基于阿片肽Biphalin和神经肽FF的嵌合肽及其合成和应用

摘要

本发明提供了一种基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽，该嵌合肽是以高效的阿片肽Biphalin和神经肽FF为化学模板，在保留阿片高效激动剂和神经肽FF“关键药效团”的基础上构建而成。体内痛觉调节、耐受和胃肠运动等一系列的药理学实验表明：本发明基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9表现出比吗啡更强的中枢镇痛活性，并具有无镇痛耐受、对胃肠运动影响小等优点，有效克服了阿片类镇痛药物普遍存在的耐受和便秘等副作用问题。此外，侧脑室注射BN-9能显著地抑制福尔马林所引起的急性痛和炎症痛，且镇痛作用稍强于吗啡，因此该嵌合肽BN-9制备临床镇痛药物方面具有潜在的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生化技术领域，涉及一种基于阿片肽和神经肽FF而构建的嵌合肽及其合成方法；本发明同时还涉及该嵌合肽在高效、低副作用镇痛药物制备中的应用。

背景技术    

疼痛是人类所经受的最常见的病症之一，每个人的一生都会经历疼痛的困扰。据统计全球大约有1/3的人忍受着持续或周期性疼痛的折磨，美国在疼痛相关社会问题的花费约为1千亿美元/年（Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2001, 98: 11845）。在临床上，吗啡类的阿片药物已被人们广泛的应用于治疗和缓解各种疼痛，但由于阿片类的镇痛药物能引起严重的耐受、成瘾、便秘和呼吸抑制等不良反应，从而大大限制了其临床应用范围。

已有的研究结果表明，机体内的阿片肽同样也能通过激活阿片受体而介导镇痛作用。为了获得选择性高、高效、分子较为稳定的阿片类配体分子，在脑啡肽等阿片肽的结构基础上通过化学修饰并筛选出了大量的高效配体。Lipkowski等人以脑啡肽为化学模板分子，通过2位氨基酸定点替换、肽链C末端肼键连接实现了分子二聚化，成功构建了一个高效的阿片肽Biphalin，其化学结构为(Tyr-DAla-Gly-Phe-NH)₂（Peptides 1982, 3:697；Life Sci 1987, 40:2283）。进一步的药理学活性研究表明，Biphalin在中枢和腹腔注射时都能引起强镇痛作用，特别是侧脑室注射时其镇痛强度为吗啡的257倍，并且腹腔注射Biphalin引起的成瘾戒断反应较小（J. Pharmacol. Exp. Ther. 1993, 265:1446）。因此，Biphalin在低副作用的阿片类镇痛药的研发中具有较好的应用前景。

众所周知，神经肽在机体内都能介导一种或多种主要的生理和药理学活性。但是，神经肽在发挥其主要活性的同时也伴随着一些次要活性，而大部分次要活性成为了它的副作用。例如，内源性阿片肽在缓解疼痛的同时，会伴随着耐受、成瘾和呼吸抑制等副作用。为了解决这一矛盾问题，传统的策略是以神经肽的母体为化学模板，进行了系统的化学修饰而筛选出受体选择性较高且具有优势构象的神经肽类似物，从而达到保持较高生物活性并降低其副作用的预期效果。

近年来还发展了一些新策略，即基于高效的肽类配体设计并合成了一系列嵌合肽，以期使嵌合肽在发挥主要活性的同时，能最大限度的降低其副作用。尤其是，Foran等人基于阿片肽EM-2和速激肽P物质（SP）而成功地设计构建了一种全新的杂合肽ESP7（Tyr-Pro-Phe-Phe-Gly-Leu-Met- NH₂），并且发现脊髓水平注射ESP7能产生阿片受体依赖的镇痛作用，但又不产生镇痛耐受的阿片样副作用（Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2000, 97:7621）。

神经肽FF最早是作为一种抗阿片肽从牛脑中被分离和鉴定的，并发现它具有抗吗啡镇痛的作用（Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1985, 82:7757）。神经肽FF系统涉及到两种不同的受体前体（Pro-NPFF_A和Pro-NPFF_B受体）和两种不同受体（NPFF₁和NPFF₂受体）（FEBS Lett. 1997, 409:426；Mol. Pharmacol. 1999, 55:804；Nat. Cell Biol. 2000, 2: 703；J. Biol. Chem. 2001, 276:36961；J. Biol. Chem. 2000, 275:25965；J. Biol. Chem. 2000, 275:39324等）。近年的药理学活性鉴定表明，NPFF及其相关肽能介导多种生物学活性，NPFF不仅具有抗阿片的功能，还具有原阿片活性，从而被归为一类重要的阿片调节肽（Curr. Top. Med. Chem. 2005, 5:341）。NPFF自身对基础痛阈值无影响，即在生理剂量水平对机体的生物学活性影响不大。但NPFF作为阿片调节肽，在维持机体的内源性阿片和抗阿片系统平衡过程中起着重要作用，它参与了镇痛耐受的调节，并能减弱吗啡等阿片物质所引起的条件位置偏爱作用（Curr. Top. Med. Chem. 2005, 5:341；Peptides. 2006, 27:964；Peptides. 2007, 28:2235；Peptides. 2010, 31:1374等）。因此，NPFF的药理学功能使其适合作为化学模板分子来发展一类全新的阿片/NPFF系统的嵌合肽。

中专利申请201110097843.4公开了一种基于内吗啡肽2和神经肽FF的嵌合肽，其在保留内吗啡肽2的N末端结构和神经肽FF的C末端结构基础上，利用内吗啡肽2的C末端和神经肽FF的N末端中都存在的苯丙氨酸残基的特点而构建的一种全新的嵌合肽EN-9。体内的药理学研究发现：EN-9表现出比内吗啡肽2更强、更持续的镇痛活性，并具有无耐受作用、低成瘾性等优点。此外，化合物EN-9皮下EN-9能引起显著的镇痛作用，能克服内吗啡肽外周注射无镇痛活性的缺陷，从而具有用于临床疼痛治疗的潜在应用价值。但是，EN-9的镇痛活性比临床用镇痛药吗啡低4-10倍，从而导致其有效镇痛剂量高于吗啡。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种镇痛效果好、副作用低的基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9。

本发明的另一目的是提供一种基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9的合成方法。

本发明还有一个目的，就是提供该基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9在制备镇痛药物中的应用。

（一）基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽

本发明基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽（BN-9），是以高效阿片肽Biphalin和神经肽FF为化学模板，构建的嵌合肽，其N末端为阿片肽“药效团” (即半个分子的Biphalin)，C末端为NPFF“药效团”(即NPFF的C端五肽结构，NPFF（3-8）)，其结构式如下：

（二）基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽的合成

本发明中基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽的合成方法，包括以下工艺步骤：

（1）树脂预处理：将Rink-Amide-MBHA树脂在二氯甲烷中搅拌30-40 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂；

（2）脱除Fmoc保护：将溶胀、抽干溶剂后的树脂在体积浓度18-25％的六氢吡啶/DMF溶液中，搅拌3-10min后抽干，重复2-3次；再加入体积浓度18-25％的六氢吡啶/DMF溶液，搅拌10-15min，使Fmoc基团脱除完全，然后抽干溶剂；最后用DMF洗涤除净六氢吡啶，得到脱除Fmoc基团保护的树脂；

（3）缩合：依次将N-α-Fmoc保护基团氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐完全溶解于DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀得混合溶液；然后在氩气保护下，将脱除Fmoc基团保护的树脂加入所述混合溶液中搅拌反应40-60min，抽干溶剂；用DMF重复洗涤除去未反应的N-α-Fmoc保护基团氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐；

所述 N-α-Fmoc保护基团氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐的用量分别为脱除Fmoc基团保护的树脂摩尔量的2-5倍；

所述二异丙基乙胺的用量为脱除Fmoc基团保护的树脂摩尔量的4-10倍；

（4）肽链的延长：重复步骤（2）、（3）8次，按照嵌合肽结构由C-末端向N-末端的顺序，依次将带有N-α-Fmoc保护基团氨基酸逐个缩合至树脂上，直至完成所有氨基酸残基的缩合，得到肽树脂；

（5）肽链从树脂上的切割：按照步骤（2）的方法将肽树脂最后一个氨基酸的 Fmoc基团完全脱除；用DCM、MeOH交替洗涤树脂，充分抽干溶剂后，按每克肽树脂加入10-25ml的切割剂，于室温下切割反应1.5-5小时；过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚中析出沉淀；静置后先去除上清的乙醚，再用水充分溶解后用分液漏斗除去乙醚相，水相经冷冻干燥，得白色粗肽固体粉末；

所述切割剂是由三氟乙酸、三异丙基硅烷、水以95:2.5:2.5的体积比混合形成的溶剂。

（6）粗肽的脱盐和纯化：以体积浓度10-20%的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的肽化合物；再利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的纯肽固体粉末。

上述方法制备的产物经质谱和色谱分析检测，与设计的化合物结构一致。表明成功合成了阿片/神经肽FF系统的全新嵌合肽，纯化后样品纯度在98％以上。

（三）基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽的活性实验

本发明基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9，同时保留了激活阿片和NPFF受体的两个关键药效团，在保持了阿片镇痛作用的同时，能有效地降低阿片镇痛耐受和便秘等副作用。下面通过体内实验说明本发明的嵌合肽BN-9在痛觉调节、耐受和便秘方面的药理学功能。

1、BN-9的镇痛实验

通过侧脑室、脊髓和尾静脉三个水平注射后，利用小鼠光热甩尾实验进行了体内痛觉调节作用的活性检测和比较。并以阳性对照药物吗啡作为对照组。

（1）小鼠的侧脑室给药

侧脑室水平痛觉检测实验用小鼠，需提前进行小鼠的侧脑室埋管手术，以保证药物注射位点的准确性。利用脑立体定位仪进行小鼠的侧脑室埋管。昆明系雄性小鼠，体重20±2 g；脑立体定位仪为江湾I型。小鼠用戊巴比妥钠麻醉（i.p，80mg/kg小鼠体重）后，将小鼠头部手术区剪去毛发，置于脑立体定位仪上固定后，手术区用碘伏消毒，沿矢状缝切开头皮，露出颅骨，找到前囟位置。从前囟向后3 mm，向左/右1 mm，即为侧脑室的上方位置。自制不锈钢管（24-gauge的一段，上面接一小段PE-10管）按上述位置向下插入3 mm，即为侧脑室。一段不锈钢琴弦（28-gauge）插入到上述钢管中，以防止脑脊液外溢、感染和堵塞钢管。用医科牙托粉和胶水固定钢管，凝固后，缝合伤口。手术后，小鼠恢复4天，第5天开始后续实验。实验中涉及到的手术器械、不锈钢管等均已在手术前消毒。药物溶解在生理盐水中，在-20℃保存，使用前解冻。

（2）小鼠的鞘内和尾静脉注射

脊髓水平给药采用清醒小鼠鞘内注射法，具体操作参考Hylden和Wilcox已报道的方法（Eur. J. Pharmacol. 1980, 67:313）。将25 μl微量进样器直接插入到L5和L6之间的蛛网膜下腔。蛛网膜被刺破时伴随着小鼠猛烈而明显的甩尾动作或者尾巴呈“S”形，生理盐水和药物以5 μl/10秒的速率注射至蛛网膜下腔中。

尾静脉注射前用固定器将小鼠固定，露出整个尾巴，用75%的酒精棉球擦拭注尾部射位点使静脉扩张，此时清晰可见尾部两侧红色的静脉。注射位点在靠近尾巴根部的1/3-1/2处。选用带4号半针头的1ml注射器，注射体积为0.1ml/只。注射时用左手轻轻拉直固定尾巴，右手拿注射器沿着尾巴小于30度角倾斜进针。进针后，30秒内完成药物注射，注射完成后用棉球压迫止血。

（3）痛觉检测实验

使用昆明系雄性小鼠，利用光热甩尾仪来检测药物对痛觉作用的影响。环境温度控制在22±1℃，实验动物可自由进食、饮水。小鼠侧脑室每次注射4 μl药物。给药前先测定基础甩尾潜伏期（3-5秒），过于敏感或迟钝的小鼠弃去不用。记录给药之后第5，10，15，20，30，40，50，60，90分钟的甩尾潜伏期（尾静脉注射时痛觉检测不测定90分钟时间点的甩尾潜伏期）。为防止烫伤，将10秒设为最长甩尾潜伏期，甩尾时间超过10秒均以10秒来计。

（4）计算药物镇痛作用的MPE和EC₅₀值

痛觉调节作用利用最大可能效应MPE（maximum possible effect）值来评价，MPE（％）＝ 100×[(给药后的痛阈－基础痛阈)/(10秒－基础痛阈)]。相关的MPE数据用平均值±标准误差（Means±S.E.M.）表示，不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Dunnett检验）来进行数据的统计和分析，^***P < 0.001 表示药物处理组的MPE值与生理盐水组之间存在显著性差异。实验结果见图1~3。

BN-9和吗啡的镇痛作用通过EC₅₀值进行比较。EC₅₀值表示药物产生50%最大镇痛效应时的药物剂量。利用统计学软件GraphPad Prism 5.0版本，分别绘制了BN-9和吗啡在侧脑室、鞘内和尾静脉三种不同给药水平的最大镇痛效应时间点的MPE值的量效曲线（见图4~6），并计算出它们在不同注射水平的EC₅₀值和95%的置信区间，相关数据如表1所示。

表1 不同水平注射BN-9和吗啡所产生的镇痛作用的比较

生理盐水组为空白溶剂对照组，侧脑室注射BN-9的药物浓度分别为0.25, 0.5, 1和2 nmol。每组动物数为8只。如图1所示，小鼠侧脑室注射新化合物BN-9能剂量依赖地产生镇痛作用。BN-9在脊髓以上水平的镇痛作用能持续60分钟，并在药物注射后15分钟达到最大镇痛效应。侧脑室注射吗啡（0.5, 1, 2和4 nmol），其镇痛活性能持续90分钟，并在药物注射后30分钟达到最大镇痛效应。

同样，鞘内注射BN-9（0.125, 0.25, 0.5, 1和2 nmol）能引起量效依的镇痛作用，该作用在药物注射后10分钟达到最强，并能持续60分钟（如图2所示）。而脊髓水平注射的吗啡（0.125, 0.25, 0.5, 1和2 nmol），其镇痛活性只能持续40分钟，它在注射后10分钟时引起最大镇痛效应。

尾静脉注射1.25, 2.5, 5和10 mg的新嵌合肽BN-9时能介导剂量依赖的镇痛活性，其最大镇痛效应时间点为药物注射后的10分钟，并能维持镇痛作用60分钟（如图3所示）。同样，尾静脉注射的吗啡（0.25, 0.5, 1和2 mg）所引起的镇痛活性持续作用时间也为60分钟，最大镇痛效应的时间点为药物注射后10分钟。

如图4~6和表1所示，比较BN-9和吗啡的镇痛量效曲线作用发现，在侧脑室、脊髓和尾静脉三种不同的注射水平下，新化合物BN-9保持了较强的镇痛活性。并且，脊髓和脊髓以上水平的BN-9镇痛作用强于吗啡的，但尾静脉给药时，BN-9的镇痛作用稍弱于吗啡的。

2、BN-9的镇痛耐受实验

小鼠侧脑室连续八天注射药物，利用光热甩尾法检测它们的镇痛耐受现象，进一步比较本发明的化合物BN-9和吗啡在镇痛耐受方面的药理学活性。

（1）小鼠的痛觉耐受实验方法

昆明系雄性小鼠，侧脑室或鞘内连续注射药物八天，每天注射一次，利用光热甩尾仪来检测药物连续注射对痛觉作用的影响。环境温度控制在22±1℃，实验动物可自由进食、饮水。小鼠侧脑室每次注射4 μl药物。第一天药物注射前测定基础甩尾潜伏期（3-5秒），过于敏感或迟钝的小鼠弃去不用。实验中记录给药之后相关药物最大镇痛效应时间点的甩尾潜伏期，如侧脑室注射BN-9和吗啡的记录时间点分别为给药后15和30分钟；鞘内注射这两个药物的记录时间点均为给药物10分钟；空白溶剂对照组的时间记录点与BN-9的保持一致。为防止小鼠尾巴烫伤，将10秒设为最长甩尾潜伏期。

（2）耐受实验数据统计

实验数据用MPE（maximum possible effect）表示，MPE（％）＝100×[（给药后的痛阈－基础痛阈）/（10秒－基础痛阈）]。药物的镇痛耐受作用利用相关药物最大镇痛效应时间点的MPE值来进行比较。MPE数据用平均值±标准误差（Means±S.E.M.）来表示，小鼠八天镇痛作用的差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Bonferroni检验）进行统计， ^***P < 0.001表示与第一天吗啡镇痛作用相比有显著性差异。实验结果如图7、8所示。

生理盐水组为空白溶剂对照组，侧脑室注射BN-9的药物剂量为0.5, 1, 2和4 nmol，吗啡的剂量为4 nmol。图7的实验数据表明小鼠侧脑室连续八天注射空白溶剂对照生理盐水后，小鼠都不产生镇痛活性。与空白溶剂对照生理盐水组相比，第一天侧脑室注射吗啡和各种剂量的BN-9都显著地增加了小鼠的甩尾潜伏期。但小鼠侧脑室连续注射八天吗啡组，在给药后第四天MPE值开始显著地下降，并持续至第八天，即吗啡镇痛从第四天起就开始出现了镇痛耐受现象。与第一天相比，第四天至第八天的差异性均为极其显著（P < 0.001）。然而，0.5, 1, 2和4 nmol的BN-9侧脑室连续注射期间，其镇痛作用的MPE值都无明显变化（P > 0.05），在连续注射的八天内一直保持较好的无耐受镇痛活性。

与脊髓以上水平的镇痛耐受检测结果相一致，在脊髓水平连续八天注射0.5, 1和2 nmol的BN-9，均无镇痛耐受现象出现。与第一天的MPE相比，不同剂量BN-9在第二天至第八天的相应镇痛效应均无明显的变化。但是，鞘内注射2 nmol的吗啡，在连续给药后的第4天就开始出现镇痛耐受，并且其镇痛耐受逐渐加强。具体结果如图8所示。

3、BN-9胃肠运动调节作用的检测

阿片类镇痛药物除了耐受外，还能引起便秘等副作用。因此，对嵌合肽BN-9和吗啡在胃肠运动调节方面的作用作了进一步的评价。通过小鼠侧脑室注射药物，用碳粉胃肠运动检测法评价了它们对在体胃肠运动的影响。

（1）小鼠的在体胃肠运动检测方法

昆明系雄性小鼠，体重20±2 g。侧脑室埋管后恢复4天后用于胃肠运动检测。在体胃肠运动检测选用常用的碳粉检测法（Peptides, 2000, 21:295）。具体的实验过程为：胃肠运动实验前小鼠禁食16小时（禁食期间可随意饮水），然后侧脑室注射药物，15分钟后将预先准备好的活性炭悬浮液（一种含5%活性炭和10%阿拉伯树胶的生理盐水悬浮液）以每10 克体重0.1 ml的体积经口灌注到胃。活性炭悬浮液灌注30分钟后，颈部脱臼处死动物，然后仔细地取出从幽门到盲肠的动物小肠。测量幽门到盲肠的长度以及活性炭悬浮液移动的最远距离。

（2）在体胃肠运动实验数据统计

胃肠运动实验结果用胃肠运动百分比来评价，每只小鼠的胃肠运动百分比通过活性炭悬浮液移动距离除以小肠总长度之后的百分比来计算。相关的数据用胃肠运动百分比的平均值±标准误差（Means±S.E.M.）来表示，不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Bonferroni检验）进行数据统计和分析，^**P < 0.01, ^***P < 0.001 表示药物处理组的胃肠运动百分比与生理盐水组的之间存在显著性差异。实验结果如图9所示。

在图9中，生理盐水组为空白溶剂对照组，吗啡的药物浓度为4 nmol，BN-9的药物浓度分别为0.5， 1， 2和4 nmol。每组小鼠数为9只。实验结果表明，空白溶剂对照组的胃肠运动百分比为80 %，与生理盐水组相比，侧脑室注射4 nmol的吗啡组显著地抑制小鼠胃肠运动，其胃肠运动百分比仅为14%。然而，小鼠侧脑室注射低剂量的BN-9（0.5和1 nmol），对小鼠的胃肠运动几乎无影响；当注射2和4 nmol的BN-9时，胃肠运动百分比分别为58%和34%，高剂量的BN-9能明显地抑制小鼠的胃肠运动，但抑制作用强度低于吗啡的。由于BN-9在侧脑室水平镇痛效应的EC₅₀值要低于吗啡，因此，在有效镇痛剂量范围内，BN-9的便秘副作用要远远低于吗啡。

4、中枢注射BN-9对福尔马林致痛作用的调节

为了进一步评价BN-9的镇痛作用，利用临床前镇痛药物评价方法研究了嵌合肽BN-9对炎症痛的调节作用。在小鼠福尔马林致痛模型中，分别评价了BN-9和吗啡的镇痛活性。

（1）小鼠福尔马林致痛实验方法

昆明系雄性小鼠，体重20±2 g。侧脑室埋管后第5天用于福尔马林致痛实验。环境温度控制在22±1℃，实验动物可自由进食、饮水。具体的检测方法参考John Wiley & Sons出版社（John Wiley & Sons, Inc.）2007出版的Curr. Protoc. Neurosci.（8.9.1-8.9.16.）一书。具体实验操作为：将小鼠放入有机玻璃盒中（20×20×30 cm），先使其适应环境10-15分钟，然后给小鼠侧脑室注射药物，给药体积为5 μl。给药5 min后，将小鼠取出，用手轻柔的抓住小鼠颈部及后背的皮肤，小拇指压住小鼠的尾巴，腹部朝上固定小鼠且露出小鼠的后爪。在小鼠的右后脚掌中间皮肤下注射20 μl的福尔马林溶液（浓度为5 %），迅速将小鼠放回观察盒中，同时开始计时，并记录注射福尔马林溶液后40 分钟内小鼠行为学反应。福尔马林一般能引起两个时相的反应，根据实验需要，采用了两种行为学记录方法：（1）记录注射福尔马林后每隔1分钟小鼠舔、咬、抖被注射足的时间，共记录40 分钟；（2）记录注射福尔马林后0~5 分钟（第一相）和15-30分钟（第二相）内小鼠舔、咬、抖被注射足的时间。

（2）小鼠福尔马林致痛实验结果的统计

根据两种不同的行为学记录方法，药物对福尔马林致痛作用的影响结果统计方法也分为两种：（1）根据每隔1分钟所记录的舔、咬、抖被注射足的时间，来评价不同药物对福尔马林致痛作用的反应，具体见图10；（2）药物对福尔马林痛的调节利用MPE（maximum possible effect）值来评价，MPE（％）＝100×[ (空白溶剂对照组的舔、咬、抖被注射足时间－药物组的舔、咬、抖被注射足时间)/( 空白溶剂对照组的舔、咬、抖被注射足时间)]。数据用平均值±标准误差（Means±S.E.M.）表示，不同药物处理组各时间段内所测定的MPE值与空白溶剂对照组之间的差异用单因素方差（one-way ANOVA的Bonferroni检验）来进行分析和统计，^**P < 0.01, ^***P < 0.001 表示药物处理组的MPE值与生理盐水组相同时间段内的MPE值相比差异显著。实验结果如图11和图12所示。

图10中，生理盐水组为空白溶剂对照组，BN-9和吗啡处理组的药物浓度分别为5和10 nmol。每组动物数为7~10只。实验结果表明小鼠侧脑室注射生理盐水后，福尔马林会引起两个时相的痛觉反应，即0~5 分钟的第一相的急痛反应和15~30 分钟的第二相炎症痛反应。而侧脑室注射5 nmol的BN-9和10 nmol的吗啡能明显地抑制福尔马林所引起两相痛觉反应。进一步研究了BN-9和吗啡分别对第一相和第二相反应的镇痛作用的量效关系，具体结果如图11和图12所示。侧脑室注射BN-9的药物剂量为0.625, 1.25, 2.5和5 nmol，吗啡的剂量为1.25, 2.5, 5和10 nmol。实验结果表明不同剂量的BN-9和吗啡都对第一相急性痛具有较强的镇痛活性，其抑制率均在70 ~ 100%之间。而且，BN-9和吗啡能剂量依赖地抑制福尔马林所引起的第二相炎症痛，其量效曲线显示，BN-9对第二相炎症痛的镇痛作用稍强于吗啡。

综上所述，本发明基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9表现出比吗啡更强的中枢镇痛活性，并具有无镇痛耐受、对胃肠运动影响小等优点，有效克服了阿片类镇痛药物普遍存在的耐受和便秘等副作用问题。此外，侧脑室注射BN-9能显著地抑制福尔马林所引起的急性痛和炎症痛，且镇痛作用稍强于吗啡，因此该嵌合肽BN-9具有治疗临床疼痛的潜在应用价值。

附图说明

图1为小鼠侧脑室注射BN-9所产生的剂量依赖性镇痛作用的时效曲线；

图2为小鼠鞘内注射BN-9所产生的剂量依赖性镇痛作用的时效曲线；

图3为小鼠尾静脉注射BN-9所产生的剂量依赖性镇痛作用的时效曲线。（A）为注射；（B）为注射；

图4为小鼠侧脑室注射BN-9和吗啡所产生的镇痛作用的量效曲线；

图5为小鼠鞘内注射BN-9和吗啡所产生的镇痛作用的量效曲线；

图6为小鼠尾静脉注射BN-9和吗啡所产生的镇痛作用的量效曲线；

图7为小鼠脊髓和脊髓以上水平连续八天侧脑室注射BN-9和吗啡所引起的镇痛作用的变化；

图8为小鼠脊髓和脊髓以上水平连续八天鞘内注射BN-9和吗啡所引起的镇痛作用的变化；

图9 小鼠侧脑室注射BN-9和吗啡分别对胃肠运动的影响；

图10小鼠脑室注射高剂量BN-9和吗啡分别福尔马林所引起的急性痛和炎症痛的抑制作用；

图11小鼠脑室注射BN-9和吗啡分别福尔马林所引起的急性痛（第一相）抑制的量效曲线；

图12小鼠脑室注射BN-9和吗啡分别福尔马林所引起的炎症痛（第二相）抑制的量效曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的嵌合肽合成方法作进一步说明。

I 材料

仪器：高效液相色谱仪（HPLC）为Waters公司的Delta 600；分析柱：DELTA PAK 5μC18 300? 3.9×150mm；制备柱：DELTA PAK 15μ C18 300 ? 7.8×300mm。质谱仪为PE Biosystems，Mariner System 5074。手动固相多肽合成仪，由本实验室设计后由玻璃工制作（合成仪的设计原理具体参考Chen WC和White PD所编的《Fmoc solid phase peptide synthesis》中第14页图4，并在其基础上作了部分改进，即用以机械搅拌方式替代鼓氮气法，从而达到反应溶液充分混合的目的）。试剂：树脂为Rink-Amide-MBHA-Resin（1% DVB，200 ~ 400 mesh，取代值S = 0.40 mmol/g resin），购自天津南开和成公司。N-α-Fmoc保护的氨基酸（Fmoc-Aa）、N-羟基苯并三氮唑（HOBt）、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐（HBTU）、二异丙基乙胺（DIEA）和三异丙基硅烷（TIS）购自吉尔生化（上海）有限公司。茚三酮为上海试剂三厂产品。二氯甲烷（DCM）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、六氢吡啶（哌啶）、甲醇（MeOH）和吡啶都购自天津第二试剂厂，三氟乙酸（TFA）、苯酚和吡啶均为天津试剂一厂产品；以上有机试剂使用前均经过重蒸处理。 

 粗肽合成

采用Fmoc保护策略的固相多肽合成法。肽链延长采用逐一接肽法（step by step）。具体操作步骤如下：

（1）树脂预处理：将500 mg Rink-Amide-MBHA树脂加入合成仪中，再加入8 ml的DCM后搅拌30 min，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂。

（2）脱除Fmoc基团保护：在溶胀、抽干溶剂的树脂中，加入8 ml体积浓度20％的六氢吡啶/DMF溶液，搅拌5 min后抽干，重复2次。再加入8 ml 的体积浓度20％的六氢吡啶/DMF溶液，搅拌15 min 后抽干。最后加入8 ml 的DMF，搅拌3 min后抽干，重复4次，得到脱除Fmoc基团保护的树脂样品。

（3）茚检：按以下顺序加入试管中：树脂样品、0.1 ml试剂、0.2ml试剂、0.1 ml试剂，沸水浴3-10 min后观察。溶液、树脂均为蓝色表示Fmoc保护基团脱除完全。用于茚检的三种试剂的配方为：试剂 80 g苯酚/20ml乙醇；试剂 2.0 ml的0.001 M氰化钾（水）/ 98ml吡啶；试剂 5 g 茚三酮/100 ml乙醇。

（4）缩合：在小烧杯中用DMF依次将N-α-Fmoc保护基团氨基酸（Fmoc-Aa）、N-羟基苯并三氮唑（HOBt）、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐（HBTU）以1:1:1的摩尔比完全溶解，再加入Fmoc-Aa两倍量的二异丙基乙胺 （DIEA）后充分混匀，得混合溶液；将8 ml混合溶液和步骤（2）得到的脱除Fmoc基团保护的树脂加入到合成仪中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂。加入8 ml 的DMF，搅拌3 min后抽干，重复3次，得肽树脂样品；按照步骤（3）进行茚检，茚检溶液为淡黄、树脂为无色表示缩合完全。

（5）肽链的延长：重复步骤（2）、（4）八次，按照嵌合肽结构由C-末端向N-末端的顺序，依次将带有N-α-Fmoc保护基团氨基酸逐个缩合，每步反应完成后，经负压作用过滤去除反应器中试剂，直至完成所有氨基酸残基的缩合。

 肽链从树脂上的切割

肽链的氨基酸残基全部缩合完成后，按照上述步骤（2）中操作将肽树脂最后一个氨基酸的 Fmoc基团脱除完全。然后按照DCM 3 min×2次，MeOH 3 min×1次；DCM 3 min×1次，MeOH 3 min×2次的操作交替洗树脂。移开搅棒，将合成仪密封（胶塞），彻底抽干（至少2小时）。将干燥的肽链树脂置于反应器中，加入18ml的切割剂（体积比为TFA:TIS:水= 95:2.5:2.5），于室温下切割反应2.5小时（每15分钟搅拌一次，每次搅拌1分钟）。过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀，振荡使粗肽以白色沉淀的形式充分析出。静置后将上清液吸出，加水充分溶解析出的沉淀，用分液漏斗将乙醚从水相中分离除去，合并水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末127.8 mg，产率为57.5 %。

 粗肽的脱盐和纯化。

将全部粗产物溶于20%乙酸溶液中，将溶液过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱（2.0×25cm）, 流动相为体积浓度20%乙酸溶液。利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐处理后的白色粉末116.2 mg。再用反向高效液相色谱（HPLC）C₁₈柱（XBridge TM BEH 130 C₁₈，19 mm×250mm）对上述脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰，冷冻干燥得到白色的纯肽固体粉末82.2 mg。纯化后的BN-9样品纯度在98％以上，其合成的总产率为40%。质谱和色谱分析检测结果如表2所示。

表2  BN-9的质谱和色谱分析检测结果

注：体系1：梯度洗脱体系1为：10–100% 乙腈/水(0.05% TFA) (30 分钟完成)，流速为：1 mL/min，检测波长为220 nm，分析色谱柱为：Delta Pak C₁₈, 5 μm, 150×3.9 mm；

体系2：梯度洗脱体系2为：10–80%乙腈/水(0.05% TFA) (30 分钟完成)，流速为：1 mL/min，检测波长为220 nm，分析色谱柱为：Delta Pak C₁₈, 5 μm, 150×3.9 mm。

通过质谱结果分析说明，所合成的肽化合物BN-9与设计的化合物结构一致。色谱检测结果表明，所合成的肽化合物BN-9在两种不同体系的梯度洗脱时，其保留时间分别为16.335和17.277分钟。