扩展青霉菌脂肪酶在制备生物柴油中的应用

摘要

本发明申请提供一种获得高效表达脂肪酶菌株的方法以及利用该方法得到高表达的脂肪酶在生产生物柴油中的应用，包括：原料的预处理：将生物油脂过滤去除杂质，进行搅拌得到乳化；酯交换反应步骤：将摩尔比为1∶1-3的油脂和甲醇或乙醇加入反应容器中，然后加入上述得到的改型扩展青霉菌脂肪酶和有机溶剂，在20-50℃的反应条件下，密闭混合反应6-24小时，在反应的过程中，再次加入甲醇或乙醇，每次加入甲醇或乙醇与油脂的摩尔比为1-3∶1；生物柴油的获得：反应结束后，将所述的脂肪酶从反应物中分离出来，再将反应产物进行离心分层，静置后分离处下层的粗甘油，上层液体进行蒸馏，回收有机溶剂，得到成品生物柴油。

说明书

技术领域

本发明申请涉及扩展青霉菌脂肪酶在制备生物柴油中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

近年来脂肪酶(Lipase EC)在工业应用方面取得了很大进展，碱性脂肪酶具有对底物水解效率高、反应温和、无毒、能在一定条件下水解脂肪作用等优点，已经在洗涤剂、造纸、制革、食品、纺织及轻工业等领域得到广泛的应用，并已经成为全世界酶制剂市场上重要的品种。

通过对大量的微生物菌种进行选育，现在已经获得了一种产碱性脂肪酶能力较强的扩展青霉(P.expansium)菌株，并经过多年的诱变育种和发酵工艺改进，其产脂肪酶的能力已经得到大幅度的提高。但是，传统的菌株育种方法主要依靠随机的理化诱变，目标不明确，费时费力而且收效不明显，目前通过采用这些方法来提高该菌株产脂肪酶的能力已经非常有限，潜力小。

生物柴油(Biodiesel)是指以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及动物油脂、餐饮垃圾油等为原料油，通过酯交换工艺制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料。生物柴油是生物质能的一种，它是生物质利用热裂解等技术得到的一种长链脂肪酸的单烷基酯。生物柴油是含氧量极高的复杂有机成分的混合物，这些混合物主要是一些分子量大的有机物，几乎包括所有种类的含氧有机物，如：醚、酯、醛、酮、酚、有机酸、醇等。

生物柴油作为全球能源紧缺状况下的一种优良的可替代能源，具有广阔的市场应用价值，是目前研究的热点。

发明内容

本发明申请即是针对现有技术中的不足之处，提供一种能够高效合成脂肪酶的青霉基因工程菌的方法。

具体来说，本发明申请所述的一种获得高效表达脂肪酶菌株的方法，其特征在于：所述的方法包括如下的步骤：

1、获得潮霉素抗性表达盒并克隆至目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；

2、分别扩增青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉的强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；

3、将该PEL基因表达盒插入到潮霉素抗性的重组质粒中，获得了含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体；

4、将含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEL基因表达盒转化到青霉菌株中，获得高表达脂肪酶的青霉基因工程菌。

其中所述的青霉菌为扩展青霉。

所述的目标质粒为下列之一：

pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300或pHB。

本发明申请还涉及将所述的青霉基因工程菌应用于制备脂肪酶。

所述的应用是将所述的青霉基因工程均以5-20％接重量，接种到发酵培养基，在25-35℃、200-300rpm条件下，发酵2天后，经分离纯化得到所述的脂肪酶。

通常，是将所述的青霉基因工程菌以菌丝体或孢子悬液接入种子培养基在25-35℃、200-300rpm条件下培养24小时后，以5％-20％接种量转入发酵培养基，在25-35℃、150-300rpm条件下发酵2天后，经分离纯化得到所述的脂肪酶。

本发明中所用到的培养基如下：

PDA培养基(g/L)：马铃薯，200；蔗糖，20；琼脂，15；PH自然；

MM培养基：1M K₂HPO₄-KH₂PO₄(PH7.0)10mL，M-N(MgSO₄·7H₂O 30g/L，NaCl 15g/L)20mL，1％CaCl₂·2H₂O 1mL，20％葡萄糖10mL，0.01％FeSO₄ 10mL，Spore element(ZnSO₄·7H₂O 100mg/L，CuSO₄·5H₂O 100mg/L，H₃BO₃ 100mg/L，MnSO₄·H₂O 100mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 100mg/L)5mL，20％NH₄NO₃ 2.5mL，无菌水941.5mL；

IM培养基：1.25M K-buffer(PH4.9)10mL，M-N(MgSO₄·7H₂O 30g/L，NaCl 15g/L)20mL，1％CaCl₂·2H₂O 1mL，20％葡萄糖10mL，0.01％FeSO₄ 10mL，Spore element(ZnSO₄·7H₂O 100mg/L，CuSO₄·5H₂O 100mg/L，H₃BO₃ 100mg/L，MnSO₄·H₂O 100mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 100mg/L)5mL，20％NH₄NO₃ 2.5mL，50％甘油10mL，1M MES(PH5.5)40mL，100mM AS(乙酰丁香酮)2mL，无菌水898.7mL；

CM培养基：加一半IM培养基的葡萄糖量，外加1.5％琼脂，其它成份同IM培养基；

种子培养基(％)：黄豆饼粉4，玉米淀粉0.8，Na NO₃ 0.3，Na₂HPO₄ 0.2，K₂SO₄ 0.25，MgSO₄ 0.03，FeSO₄ 0.003；

发酵培养基(％)：黄豆饼粉6，玉米淀粉1，NaNO₃ 0.4，Na₂HPO₄ 0.2，K₂SO₄0.3，MgSO₄ 0.035，FeSO₄ 0.02，CaCO₃ 0.5，Na₂CO₃ 0.02。

本发明所述的青霉基因工程菌及其制备与应用的有益效果主要体现在：

1、运用基因工程技术对青霉菌进行改良，育种目标明确，效率高；

2、所得工程菌产脂肪酶能力强，比工程菌的出发青霉菌菌株提高了70％以上。

本发明申请还涉及利用所述的改型脂肪酶制作生物柴油的方法：

用生物酶法合成生物柴油，即用动物油脂和低碳醇通过脂肪酶进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯及乙酯。酶法合成生物柴油具有条件温和、醇用量小、无污染排放的优点。由于利用物酶法合成生物柴油具有反应条件温和、醇用量小、无污染物排放等优点，具有环境友好性，因而日益受到人们的重视。

具体来说，所述的方法包括如下步骤：

1、原料的预处理：将生物油脂过滤去除杂质，然后进行搅拌得到乳化，其中搅拌速度为5000-10000rpm，搅拌时间为5-15min；

2、酯交换反应步骤：将摩尔比为1∶1-3的油脂和甲醇或乙醇加入反应容器中，然后加入上述得到的改型扩展青霉菌脂肪酶和有机溶剂，在20-50℃的反应条件下，密闭混合反应6-24小时，在反应的过程中，再次加入甲醇或乙醇，每次加入甲醇或乙醇与油脂的摩尔比为1-3∶1；

3、生物柴油的获得：反应结束后，将所述的脂肪酶从反应物中分离出来，再将反应产物进行离心分层，静置后分离处下层的粗甘油，上层液体进行蒸馏，回收有机溶剂，得到成品生物柴油。

其中，在步骤2中，所述的改型扩展青霉菌脂肪酶与原料油的摩尔比为1∶12-20，有机溶剂与原料油的摩尔比为1∶0.5-1.5。

所述的有机溶剂包括但不限于石油醚、异辛烷、正己烷、正庚烷、环己烷和三氯甲烷。

所述的原料油包括但不限于菜籽油、大豆油、棉籽油、花生油、玉米油、猪油、鱼油和微生物油脂。

本发明申请所得到的生物柴油，具有以下的优点：

1.具有优良的环保特性：主要表现在由于生物柴油中硫含量低，使得二氧化硫和硫化物的排放低，可减少约30％(有催化剂时为70％)；

2.生物柴油中不含对环境会造成污染的芳香族烷烃，因而废气对人体损害低于柴油，检测表明，与普通柴油相比，使用生物柴油可降低90％的空气毒性，降低94％的患癌率；由于生物柴油含氧量高，使其燃烧时排烟少，一氧化碳的排放与柴油相比减少约10％(有催化剂时为95％)，生物柴油的生物降解性高；

3.具有较好的低温发动机启动性能。无添加剂冷滤点达-20℃；

4.具有较好的润滑性能：使喷油泵、发动机缸体和连杆的磨损率低，使用寿命长；

5.具有较好的安全性能，由于闪点高，生物柴油不属于危险品。因此，在运输、储存、使用方面的安全性又是显而易见的；

6.具有良好的燃料性能：十六烷值高，使其燃烧性好于柴油，燃烧残留物呈微酸性，使催化剂和发动机机油的使用寿命加长；

7.具有可再生性能：作为可再生能源，与石油储量不同，其通过农业和生物科学家的努力，可供应量不会枯竭；

8.无须改动柴油机，可直接添加使用，同时无需另添设加油设备、储存设备及人员的特殊技术训练；

9.生物柴油以一定比例与石化柴油调和使用，可以降低油耗、提高动力性，并降低尾气污染。

附图说明

附图为超表达载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC的构建路线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明申请所述的本发明申请所述的获得高效表达脂肪酶菌株的方法以及利用该脂肪酶生产生物柴油的方法进行进一步描述，目的是为了公众更好的理解本发明的技术内容，而不是对所述技术内容的限制，事实上，在本发明精神实质内，对本发明申请所述方法的改进，目标质粒和限制性内切酶的替换都是本领域一般技术人员无需创造性的劳动即可获得的，因此都在本发明申请所要求保护的技术方案之内。

实施例一、超表达载体的构建

采用如下的步骤：

(1)利用限制性内切酶Sac I，Kpn I将潮霉素抗性表达盒从质粒PV2⁺上酶切出来，片段经凝胶回收，克隆到pCAMBIA2300质粒的相应酶切位点上，获得具有潮霉素抗性的重组质粒pCHAMBIA2302；潮霉素表达盒也可来自其它含该序列的任何DNA或者直接合成，用于构建PEL基因超表达载体的质粒除pCAMBIA2300外，还可用能在丝状真菌中表达的质粒如pCAMBIA1300、pCAMBIA3300等pCAMBIA系列载体和pHB载体；

(2)根据扩展青霉菌P.expansium的脂肪酶基因PEL(AF330635)的序列设计引物(正向引物：TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT下划线的序列为限制性酶Spe I切点；反向引物：TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC下划线的序列为限制性酶Not I切点)，利用PCR技术扩增全基因序列，PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃90s，35个循环；72℃10min；

(3)根据质粒pPAN7-1(Punt et al.1987 Gene 56：117-124)的序列设计引物(正向引物：GCTATCTGAGCTGATAAGCGGCCGCGGATCCACTTAACGTTA，下划线的序列为限制性酶Not I切点；反向引物：GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC，下划线的序列为限制性酶PmeI切点)，利用PCR技术扩增出色氨酸合成酶终止子TtrpC，PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min；

(4)取(2)和(3)的反应液各1μL作为模板，以(TGACTAGTATGTTGTTCAACTACCAATCTTT)作为正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作为反向引物，进行PCR扩增，PCR的反应条件为：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃150s，35个循环；72℃10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行凝胶柱回收，并克隆到PMD-18-T：载体，获得中间载体PMD-18-T::PEL-TtrpC；

(5)根据质粒pPAN7-1(Punt et al.1987 Gene 56：117-124的序列设计引物(正向引物：GAGTCGAC GAATTCCCTTGTATCTCTACACAC下划线的序列为限制性酶Not I切点；反向引物：GAACTAGTCTGCTCAAGCGGGGTAGCTGTTAGT下划线的序列为限制性酶PmeI切点)利用PCR技术扩增强启动子PgpdA。PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃150s，35个循环；72℃10min。利用限制性内切酶Sal I和Spe I将PgpdA克隆到载体PMD-18-T::PEL-TtrpC的相应位点，获得中间载体PMD-18-T::PgpdA-PEL-TtrpC；

(6)利用限制内切酶Sal I和Pme I对载体PMD-18-T::PgpdA-PEL-TtrpC进行消化，回收表达盒PgpdA-PEL-TtrpC，然后克隆至pCHAMBIA2302相应位点，获得最终载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC，整个的构建过程如附图所示；

(7)对含有最终载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC的菌进行扩大培养，并抽提质粒，利用冻融法转化工程农杆菌EHA105，随机挑选6株转化子，以(TGACTAGT ATGTTGTTCAACTACCAATCTTT)作为正向引物；以(TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC)作为反向引物，以载体PMD-18-T::PEL-TtrpC为阳性对照，空EHA105为阴性对照，对这6株菌进行PCR鉴定，结果显示这6株菌均为阳性。

实施例二、青霉基因工程菌的获得

所述青霉基因工程菌的获得包括如下的步骤：

(1)挑取分离纯化后的野生型青霉接种于PDA平板上，于28℃培养20天左右，用无菌水洗下成熟孢子；

(2)将实例一中含终载体pCHAMBIA2302::PgpdA-PEL-TtrpC的工程农杆菌EHA105接种于含有链霉素、卡那霉素(均为100μg/ml)的LB液体培养基中28℃，200rpm过夜培养，用含有链霉素和卡那霉素(均为100μg/ml)的MM培养基重新活化，28℃，220rpm培养48小时。吸取适量的培养物5000rpm离心去上清，并用IM液体培养基洗涤，最后用IM液体培养基稀释至OD600＝0.15，然后在28℃，220rpm的条件下培养6-8小时，至OD600＝0.5-0.6；

(3)将第(1)步得到的新鲜孢子配制成1×10⁷个/mL浓度的悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤(2)中的工程农杆菌等体积混合，取200μL均匀涂布到铺有玻璃纸的IM固体培养基(含AS 200μg/mL)之上，28℃共培养60h，然后将玻璃纸反铺到含有潮霉素(100μg/mL转化选择抗生素)、头孢菌素(500μg/mL，抑制农杆菌生长抗生素)的PDA培养基上28℃培养2天，揭下玻璃纸，在28℃条件下培养1-3天，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，即是所述的青霉基因工程菌，如此获得了30株青霉基因工程菌。随机挑选5株转化子进行扩大培养，并分别抽提基因组DNA，以(TGACTAGTATGTTGTTCAACTACCAATCTTT)作为正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作为反向引物，以载体PMD-18-T::PEL-TtrpC为阳性对照，野生型青霉基因组DNA为阴性对照，对这5株菌进行PCR鉴定，结果显示这5株菌均为阳性。

MM培养基的成分如下所述：

1M K₂HPO₄-KH₂PO₄(PH7.0)10mL，M-N(MgSO₄·7H₂O 30g/L，NaCl 15g/L)20mL，1％CaCl₂·2H₂O 1mL，20％葡萄糖10mL，0.01％FeSO₄ 10mL，Spore element(ZnSO₄·7H₂O 100mg/L，CuSO₄·5H₂O 100mg/L，H₃BO₃ 100mg/L，MnSO₄·H₂O 100mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 100mg/L)5mL，20％NH₄NO₃ 2.5mL，无菌水941.5mL。

IM培养基的成分如下所述：

1M K-buffer(PH4.9)10mL，M-N(MgSO₄·7H₂O 30g/L，NaCl 15g/L)20mL，1％CaCl₂·2H₂O 1mL，20％葡萄糖10mL，0.01％FeSO₄ 10mL，Spore element(ZnSO₄·7H₂O 100mg/L，CuSO₄·5H₂O 100mg/L，H₃BO₃ 100mg/L，MnSO₄·H₂O 100mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 100mg/L)5mL，20％NH₄NO₃ 2.5mL，50％甘油10mL，1M MES(PH5.5)40mL，100mM AS(乙酰丁香酮)2mL，无菌水898.7mL

CM培养基：加一半IM培养基的葡萄糖量，外加1.5％琼脂，其它成份同IM培养基。

PDA培养基(g/L)：马铃薯，200；蔗糖，20；琼脂，15；PH自然。

实施例三

本发明申请是在有机溶剂油——水界面上完成的酯交换反应，酯交换合成酯化率可达到85-95％。

本发明中使用的脂肪酶是采用本发明得到的改型扩展青霉菌脂肪酶，然后采用固定化处理的方法，其中，所述的固定化方法包括如下步骤：在缓冲液中加入酶粉，搅拌使其充分溶解，然后将一定量的硅藻土加入酶液中，恒温振荡一定时间后，离心收集固体，将固定化载体用丙酮清洗3-5次，使载体颗粒分散，再用蒸馏水清洗3-5次，将丙酮洗掉，冷冻干燥后即得到固定化的脂肪酶。

实施例四

具体来说，所述的方法包括如下步骤：

1.原料的预处理：将菜籽油过滤去除杂质，然后进行搅拌得到乳化，其中搅拌速度为5000rpm，搅拌时间为15min；

2.酯交换反应步骤：将摩尔比为1∶3的菜籽油和甲醇加入反应容器中，然后加入上述得到的固定化的改型扩展青霉菌脂肪酶和正己烷，所述的改型扩展青霉菌脂肪酶与菜籽油的摩尔比为1∶12，正己烷与菜籽油的摩尔比为1∶0.5-1.5，在20℃的反应条件下，密闭混合反应24小时，在反应的过程中，再次加入甲醇，每次加入甲醇与菜籽油的摩尔比为1-3∶1；

3.生物柴油的获得：反应结束后，将所述的脂肪酶从反应物中分离出来，再将反应产物进行离心分层，静置后分离处下层的粗甘油，上层液体进行蒸馏，回收正己烷，得到成品生物柴油。

实施例五

所述的方法包括如下步骤：

1.原料的预处理：将花生油过滤去除杂质，然后进行搅拌得到乳化，其中搅拌速度为10000rpm，搅拌时间为5min；

2.酯交换反应步骤：将摩尔比为1∶1的花生油和乙醇加入反应容器中，然后加入上述得到的改型扩展青霉菌脂肪酶和环己烷，所述的改型扩展青霉菌脂肪酶与花生油的摩尔比为1∶12-20，环己烷与花生油的摩尔比为1∶0.5-1.5，在50℃的反应条件下，密闭混合反应6小时，在反应的过程中，再次加入乙醇，每次加入乙醇与花生油的摩尔比为1-3∶1；

3.生物柴油的获得：反应结束后，将所述的脂肪酶从反应物中分离出来，再将反应产物进行离心分层，静置后分离处下层的粗甘油，上层液体进行蒸馏，回收环己烷，得到成品生物柴油。

实施例六

具体来说，所述的方法包括如下步骤：

1.原料的预处理：将猪油过滤去除杂质，然后进行搅拌得到乳化，其中搅拌速度为7000rpm，搅拌时间为10min；

2.酯交换反应步骤：将摩尔比为1∶2的猪油和甲醇加入反应容器中，然后加入上述得到的改型扩展青霉菌脂肪酶和石油醚，所述的改型扩展青霉菌脂肪酶与猪油的摩尔比为1∶12-20，石油醚与猪油的摩尔比为1∶0.5-1.5，在20-50℃的反应条件下，密闭混合反应6-24小时，在反应的过程中，再次加入甲醇，每次加入甲醇与猪油的摩尔比为1-3∶1；

3.生物柴油的获得：反应结束后，将所述的脂肪酶从反应物中分离出来，再将反应产物进行离心分层，静置后分离处下层的粗甘油，上层液体进行蒸馏，回收石油醚，得到成品生物柴油。

依据本发明申请获得的改型扩展青霉菌脂肪酶加工制造生物柴油，有效的缓解了能源紧缺的问题，并且所述方法反应时间短、工艺简化、生物柴油的转化率高，并且该方法还具有能耗低、产品易于回收和无污染物排放等特点。