番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗

摘要

本发明公开了番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联疫苗的制备及应用，该二联疫苗以番鸭细小病毒弱毒P1株(保藏编号：CCTCC V201013)和番鸭肝白点病(番鸭呼肠孤病毒病)弱毒MWCA株(保藏编号：CGMCC 0667)为种毒，分别应用番鸭胚成纤维细胞和SPF鸡胚成纤维细胞转瓶培养技术增殖病毒，收获细胞毒液，按适当比例混合后加冻干保护剂冷冻干燥，制成二联活疫苗，在流行番鸭三周病和肝白点病的番鸭养殖地区应用。

说明书

技术领域

本发明涉及番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗，属于预防兽医学领 域。

背景技术

番鸭细小病毒病(俗称“三周病”)是1987年在我省首次发生的1-3周龄雏番鸭以 喘泻为临床症状的一种新疫病。该病主要侵害7-21日龄的雏番鸭，发病率27-62％和 病死率22-43％，病愈鸭大部分成为僵鸭，给番鸭业造成很大经济损失。番鸭呼肠孤病 毒病(俗称“肝白点病”、“花肝病”、“白点病”、“肝脾白点病”和“番鸭坏死性肝炎”等) 是1997年以来，在福建省莆田、福清、福州、长乐和浙江金华、广东佛山等地番鸭饲 养区发生一种临床上以软脚为主要症状，以肝、脾表面有多量白点、肾脏肿大、出血、 表面有黄色条斑为主要病理变化的传染病。该病只发生于番鸭，发病日龄为7～45日 龄，以10～30日龄的雏番鸭为最甚。发病率为30～90％，病死率为60～80％，发病 未死鸭耐过后成为僵鸭，给番鸭业造成很大经济损失。

目前，番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病仍是严重危害番鸭养殖业的重要传染 病，疫苗的免疫接种可有效控制这二种新发疫病，而多次免疫对番鸭群易造成不良的 应激反应。为此，本发明在国内外首次研制出番鸭呼肠孤病毒病和番鸭细小病毒病二 联活疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗，本发明是 通过如下技术方案来实现的：

a、来源于人工致弱的番鸭细小病毒弱毒P1株(MPV-P1株)，保藏在中国典型培 养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称：CCTCC)，保藏单位CCTCC 地址在中国武汉市武汉大学，保藏日2010年6月2日，保藏编号：CCTCCNO：V201013；

b、来源于人工致弱的番鸭肝白点病(番鸭呼肠孤病毒病)弱毒MWCA株，该 毒株保藏在在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)， 保藏单位地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏日2001 年12月18日，保藏编号：CGMCC0667；

将上述的番鸭肝白点病弱毒MWCA株和番鸭细小病毒弱毒P1株应用于制备番 鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗。

与现有技术相比，本发明以番鸭细小病毒弱毒P1株(MPV-P1株)和番鸭肝白点 病弱毒MWCA株(即：番鸭呼肠孤病毒弱毒CA株)为种毒，分别应用番鸭胚成纤 维细胞和SPF鸡胚成纤维细胞转瓶培养技术增殖病毒，收获细胞毒液，按适当比例混 合后加冻干保护剂冷冻干燥，研制成遗传性稳定、安全性好、免疫原性强且成本低的 二联活疫苗，在流行番鸭三周病和肝白点病的番鸭养殖地区应用，能达到一次免疫接 种即可同时预防和控制这二种疫病的目的，1-2日龄雏番鸭免疫一次即可有效预防番鸭 细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病，不仅减少了人力物力，也减少因多次免疫注射对鸭 群造成的不良应激反应；本发明适于GMP条件下的大规模生产。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进一步说明。(但不是对本发明的限制)。

a、来源于人工致弱的番鸭细小病毒弱毒P1株(MPV-P1株)，是利用番鸭胚和番鸭 胚成纤维细胞交替传代等生物技术人工选育致弱而成，已失去对一日龄雏番鸭的致病 性，并具有如下特性(1)病毒效价：MPV-P1株对番鸭胚成纤维单层细胞 TCID₅₀≥10^-50/0.1ml；(2)安全性：用1日龄健康易感雏番鸭10羽，每羽腿部肌肉注射 毒种原液0.2毫升，观察20天，应全部存活；(3)免疫原性：一日龄健康敏感雏番鸭， 腿部肌肉注射0.2毫升，其最小免疫量为100TCID₅₀。MPV-P1株保藏在CCTCC，保 藏日2010年6月2日，保藏编号CCTCCV201013；

b来源于人工致弱的番鸭肝白点病(番鸭呼肠孤病毒病)弱毒MWCA株，是利 用番鸭胚成纤维细胞和鸡胚成纤维细胞传代诱变选育致弱而成，已失去对一日龄雏番 鸭的致病性，并具有如下特性(1)病毒效价：MWCA株对鸡胚成纤维单层细胞 TCID₅₀≥10^-50/0.1ml；(2)安全性：用1日龄健康易感雏番鸭10羽，每羽腿部肌肉注射 毒种原液0.2毫升，观察20天，应全部存活；(3)免疫原性：一日龄健康易感雏番鸭， 腿肌注射0.2毫升，其最小免疫量为300TCID₅₀。该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，(现名：中国普通微生物菌种保藏管理中心，China General  Microbiological Culture Collection Center，简称CGMCC)，地址在北京市朝 阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏日2001年12月18日，保藏编号： CGMCC0667。(见已授权中国专利号01144485.1，授权公告号CN1179751C；番鸭肝白 点病(番鸭呼肠孤病毒病)弱毒MWCA株在该专利文献中也称：CGMCC0667毒株)；

将上述的番鸭细小病毒弱毒P1株和番鸭肝白点病(番鸭呼肠孤病毒病)弱毒 MWCA株用于制备番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗。

上述的番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病二联活疫苗的具体制备方法如下：

(1)MPV-P1株增殖，将MPV-P1株种毒按培养液量的1％同步接种番鸭胚成纤维 细胞(MDEF)，37℃旋转培养至细胞病变达75％以上，收获MPV-P1细胞毒。

(2)MDRV-CA株增殖，将MDRV-CA株种毒接培养液量的1％同步接种SPF鸡 胚成纤维细胞(CEF)，37℃旋转培养至细胞病变述75％以上，收获MDRV-CA细胞毒。

(3)病毒含量TCID₅₀测定，MDRV-CA和MPV-P1的TCID50分别≥10^-50/0.1ml 和≥10^-4.5/0.1ml以上时，可用于配制疫苗。

(5)疫苗配制，将MPV-P1和MDRV-CA按适当比例混合后加冻干保护剂冷冻干 燥而成。使每羽份疫苗中各种成份的病毒含量分别达MDRVCA10^3.5TCID₅₀和MPV-P1 10³⁰TCID₅₀。

本发明的疫苗应用于防治番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病，其免疫学指标测 定如下：

1.无菌检验：按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行，无菌生长。

2.安全性测定：用1日龄健康易感雏番鸭10羽，每羽腿部肌肉注射10倍剂量三 联疫苗，观察20天，接种鸭均未见饮食欲和精神异常，且生长发育良好，全部存活。

3.免疫力测定：随机取一日龄易感雏番鸭20羽，腿肌接种1羽份二联活疫苗， 其中10羽免疫鸭于接种0天、7天、14天、21天、28天、60天、90天、150天、180 天连同不免疫对照鸭采血分离血清，供抗MPV-LPAI抗体效价测定；另10羽免疫鸭于 接种后7天连同不免疫对照组同时攻击MDRV强毒，观察20天，记录发病死亡情况。 结果：①一日龄雏番鸭二联苗免疫后5天产生抗体，免疫后7天血清中的抗MPV-LPAI 抗体均为2^2.1以上，能有效抵抗MPV强毒攻击，至免疫后28天达到高峰的抗体水平 分别为2^6.0，随后抗体水平仍雏持在较高水平，并一直持续至免疫后180天，此时已超 过番鸭出栏日龄。②一日龄雏番鸭二联苗免疫后7天连同不免疫对照组同时攻击 MDRV强毒0.2ml/羽，对照攻毒鸭的发病率80％(8/10)、死亡率30％(3/10)；而免 疫攻毒鸭的发病率10％(1/10)、死亡率0％；表明一日龄雏番鸭免疫二联疫苗后7天 能有效抵抗MDRV强毒的攻击。③二联疫苗的免疫力测定结果表明，疫苗免疫力良好， 免疫产生期7天，免疫持续期为180天以上。一次免疫即可保护雏番鸭安全渡过易感 期，达到1次免疫注射可同时预防番鸭细小病毒病(番鸭三周病)和番鸭呼肠孤病毒 病(番鸭肝白点病)，不仅减少人力物力财力，也减少因多次免疫注射导致的应激反应。

本发明的应用效果评价：在曾流行番鸭三周病和番鸭肝白点病的试验鸭场共免疫 注射6500多羽份一日龄雏番鸭，跟踪观察20d，未见免疫鸭出现不良反应；且免疫组 番鸭未发生番鸭细小病毒病和番鸭呼肠孤病毒病，成活率达97.5％以上；而650羽的 对照组番鸭均不同程度发生番鸭肝白点病和三周病，成活率仅73％。进一步证明本发 明的二联活疫苗安全、有效，可用于临床上预防番鸭呼肠孤病毒病(番鸭肝白点病) 和番鸭细小病毒病(番鸭三周病)。