一种抗卵巢功能衰退中药黄酮提取物、制备方法及用途

摘要

本发明涉及中药领域，涉及一种抗卵巢功能衰退中药黄酮提取物、制备方法及用途。具体为：取原料药：菟丝子100-400份，红花7-32份，按量混合并与6-10倍于原料药重量的大极性提取液搅拌均匀后的混合物，在静止状态下提取。收集提取液，减压浓缩到密度为溶液密度为0.8-1.3g/ml，用沸程30-60℃石油醚等体积萃取3-6次脱脂，弃去石油醚层，取萃取水层用乙酸乙酯等体积萃取3-6次，旋转蒸发萃取液，干燥后得到粉末，为粗提黄酮部位；采用HPD450大孔吸附树脂进行柱层析，收集洗脱液，减压回收乙醇，减压浓缩、干燥得总黄酮部位。本发明从有效部位层面，通过适当的提取纯化方法和技术，尽可能多地提取和保留其中的黄酮成分，以保证中药复方的药效，提高疗效，减少服用量，活性明确，毒副作用小。

说明书

技术领域

本发明涉及中药领域，涉及一种抗卵巢功能衰退中药黄酮提取物、制备方法及用途。 

背景技术

卵巢功能衰退可引发不孕不育、生殖系统、心血管系统、骨质疏松等系列疾病，卵巢过早衰退(Premature ovarian failure，POF，即卵巢早衰)致使患者生活质量下降。此外，随着社会经济的发展，越来越多的职业女性选择延迟生育时间，但女性的最佳生殖时间窗同样受到卵巢功能的严重限制。因此探讨卵巢功能衰退衰老机制、预测卵巢功能衰退的指标以及防治卵巢功能过早衰退的措施是当今生殖健康领域的研究热点和难点。 

流行病学研究显示卵巢早衰的发生率为1%，然而这l%的妇女如何最终达到卵巢衰竭的状态，POF初始阶段的状态如何，目前仍有很多未知。有研究发现，随年龄增加，卵泡密度逐渐下降，35岁以上妇女卵泡密度明显降低，是35岁以下者卵泡密度的1/4，40岁以上妇女卵泡密度急剧降低，部分妇女卵泡密度降至0。Nikolaou估计在一般人群中至少有10%的妇女经历着过早的卵巢衰退，那根据POF的1%发生率，至少有9%的妇女处于卵巢衰退的早期状态，有专家对此状态命名为卵巢早老化(premature ovarian aging，POA)，并对两者病因学进行比较研究，结果支持了POA是POF一种早期阶段表现的观点。有研究提示治疗高促性腺激素闭经的效果与病程以及促卵泡生成素(FSH)水平有关。 

激素替代治疗（Hormone replacement therapy，HRT）是目前现代医学治疗卵巢衰老相关症状和疾病的重要方法，但现有研究明显表明其具有多种副作用和远期致癌性，使其临床应用受到明显的限制。 

发明内容

本发明针对现有技术不足，根据中国遵循传统中医理论，采用中药方剂治疗，通过“补肾益阴、疏肝养血”而达到延缓卵巢衰老的目的。本发明提供了一种菟丝子和红花组方形成的抗卵巢功能衰退有效中药复方，从有效部位层面，通过适当的提取纯化方法和技术，尽可能多地提取和保留其中的黄酮成分，以保证中药复方的药效，提高疗效，减少服用量，活性明确，毒副作用小。 

本发明目的是通过下面的技术方案实现的： 

一种抗卵巢功能衰退的中药黄酮提取物，由如下方法制备而成： 

1）按以下重量份取原料药：菟丝子100-400份，红花7-32份，按量混合并与6-10倍量大极 性提取液搅拌均匀后的混合物，在静止状态下提取，可采用超声振荡法、加热回流提取法或逆流提取法，使混合物中的原料的活性成分更多溶解到大极性提取液中。所述大极性提取液优选水，甲醇，乙醇，或是它们的任意混合液；特优选为浓度60-80%（体积百分比），PH值为5.6-6.3的乙醇溶液； 

2）收集提取液，减压浓缩到密度为0.8-1.3g/ml，用沸程30-60℃石油醚等体积萃取3-6次脱脂，弃去石油醚层，取萃取水层用乙酸乙酯等体积萃取3-6次，旋转蒸发萃取液，干燥后得到粉末，为粗提黄酮部位。 

3）采用HPD450大孔吸附树脂，优选以0.2g粗提黄酮/ml的上样液浓度上样，分别用8倍（与湿树脂量相比）蒸馏水洗去杂质，然后用70%乙醇洗脱纯化总黄酮，收集洗脱液，减压回收乙醇，减压浓缩、干燥得总黄酮部位。 

上述中药黄酮提取物，可以单独或与一种或一种以上的药学上可接受的载体组合制成制剂以供给药，如针剂、输液、滴丸、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等。 

本发明中药黄酮提取物各种剂型可以按照药学领域中熟知的方法进行制备。这些药用制剂中可以含有与载体组合的例如0.05%~90%重量的活性成分，更常见约15%~60%之间重量的活性成分。 

本发明还提供了一种制备本发明所述抗卵巢功能衰退的中药黄酮提取物的的方法，包括如下步骤： 

1）按以下重量份取原料药：菟丝子100-400份，红花7-32份，按量混合并与6-10倍量大极性提取液搅拌均匀后的混合物，在静止状态下用超声振荡法、加热回流提取法或逆流提取法，使混合物中的原料的活性成分更多溶解到大极性提取液中。所述大极性提取液优选水，甲醇，乙醇，或是它们的任意混合液；特优选为浓度60-80%，PH值为5.6-6.3的乙醇溶液； 

2）收集提取液，减压浓缩到密度为0.8-1.3g/ml，用沸程30-60℃石油醚等体积萃取3-6次脱脂，弃去石油醚层，取萃取水层用乙酸乙酯等体积萃取3-6次，旋转蒸发萃取液，干燥后得到粉末，为粗提黄酮部位。 

3）采用HPD450大孔吸附树脂，以0.2g粗提黄酮/ml的上样液浓度上样，分别用8倍（与湿树脂量相比）蒸馏水洗去杂质，然后用70%乙醇洗脱纯化总黄酮，收集洗脱液，减压回收乙醇，减压浓缩、干燥得总黄酮部位。 

本发明还提供了一种上述中药黄酮提取物在制备抗卵巢功能衰退药物中的应用。 

本发明所述中药黄酮提取物采用的中药复方由菟丝子和红花组成，其中，菟丝子性温，味甘，能滋补肝肾，固精缩尿，安胎，明目，止泻，用于阳痿遗精、尿有余沥、遗尿尿频、 腰膝酸软、目昏耳鸣、肾虚胎漏、胎动不安、脾肾虚泻；外治白癜风。红花性温，味辛，活血通径、散瘀止痛，用于经闭、痛经、恶露不行、症瘕痞块、跌打损伤，适用各种静脉曲张，末梢神经炎，血液循环不好，腿脚麻木或青紫等淤血症。菟丝子为补阳之药，有补肾益精，养肝明目，止泻之效，红花具活血通络，祛瘀止痛之功，与菟丝子配伍可达到补肾益精，滋阴养血，平衡阴阳，调和气血的作用，适用于肝肾阴虚之证，为补血益阴之药。菟丝子含黄酮类、树脂甙、糖类。红花含大量黄酮类化合物，另含有挥发油、植物甾醇、多糖、氨基酸、脂肪酸、脂肪油等。因此针对有菟丝子和红花组方形成的抗卵巢功能衰退有效中药复方，从有效部位层面，故通过适当的提取纯化方法和技术，尽可能多地提取和保留其中的黄酮成分，以保证中药复方的药效，是中药（复方）提高疗效，较少服用量，增加技术含量的一种可行方法。 

本发明既保留复方中各药材成分的综合作用，有利于发挥中药的多效性，又去除了组织物质和部分无效成分，延长了储存期，提高了纯度，减少了服用量，质量控制的再现性提高。 

上述中药黄酮提取物经药理实验证实其具抗卵巢功能衰退功能，所述的卵巢衰退症状优选多囊卵巢综合征、功能性月经不调、卵巢早衰或绝经期综合征。 

本发明克服现有的胶囊服用剂量大、贮存不便、时间短的特点，通过对全方原料药材用适宜的溶剂提取分离并筛选出药效较高部位，保留药材有效成分，去除组织物质和部分无效成分，活性明显提高，减少服用量，增强药物顺应性，质量控制的再现性提高，方便贮藏和运输。本发明的方法工艺简单安全，所得组合物药效强于原方药材，生产成本低，适于工业化生产，制备出的组合物为活性成分可制成各种药物剂型，如软胶囊、片剂、滴丸、缓控释剂等等。 

附图说明 

图1为流式细胞仪检测药物作用后的凋亡指数图。 

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明做进一步阐述，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。本发明的实验动物，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心（生产许可证号：SCXK(军)2007-004）。 

实施例1本发明中药黄酮提取物的提取纯化 

取100千克菟丝子和7千克红花，加入1070千克pH值为5.6的60%乙醇浸泡1小时后，回 流3小时，8层纱布过滤，药渣用428千克pH值为5.6的60%乙醇回流2小时；减压浓缩到密度为1.1g/ml，用沸程30-60℃石油醚等体积萃取5次脱脂，用乙酸乙酯等体积萃取3次，旋转蒸发萃取液，干燥后得到粉末，为粗提黄酮部位。 

采用HPD450大孔吸附树脂，以0.2g提取物/ml的上样液浓度上样，分别用8倍（与湿树脂量相比）蒸馏水洗去杂质，然后用70%乙醇洗脱纯化总黄酮，收集洗脱液，减压回收乙醇，减压浓缩、干燥得总黄酮部位。 

实施例2本发明中药黄酮提取物的提取纯化 

取250千克菟丝子和20千克红花，分别经粉碎机粉碎得到他们的粉状物，目数控制在80目。将上述粉状菟丝子和红花与2160千克pH值为6的75%的乙醇溶液混合，并在搅拌器内搅拌均匀，然后经管道缓慢流入容器，在该管道的管壁上设有超声波发生器，他对管道内缓慢流动的混合物进行超声振荡破碎处理，处理时间为30分钟，使原始细胞中的活性成分充分溶解到乙醇溶液中。将超声处理后的混合物溶液进行过滤，去除残渣，减压浓缩到密度为1.0g/ml，用沸程30-60℃石油醚等体积萃取3次脱脂，用乙酸乙酯等体积萃取4次，旋转蒸发萃取液，干燥后得到粉末，为粗提黄酮部位。 

采用HPD450大孔吸附树脂，以0.2g提取物/ml的上样液浓度上样，分别用8倍（与湿树脂量相比）蒸馏水洗去杂质，然后用70%乙醇洗脱纯化总黄酮，收集洗脱液，减压回收乙醇，减压浓缩、干燥得总黄酮部位。 

实施例3本发明中药黄酮提取物的提取纯化 

取250千克菟丝子和20千克红花，分别经粉碎机粉碎得到他们的粉状物，目数控制在80目。将上述粉状菟丝子和红花与2160千克pH值为6的75%的乙醇浸泡1小时后，回流4小时，8层纱布过滤，药渣用1620千克pH值为6的75%的乙醇回流3小时；减压浓缩到密度为0.8g/ml，用沸程30-60℃石油醚等体积萃取5次脱脂，用乙酸乙酯等体积萃取3次，旋转蒸发萃取液，干燥后得到粉末，为粗提黄酮部位。 

采用HPD450大孔吸附树脂，以0.2g提取物/ml的上样液浓度上样，分别用8倍（与湿树脂量相比）蒸馏水洗去杂质，然后用70%乙醇洗脱纯化总黄酮，收集洗脱液，减压回收乙醇，减压浓缩、干燥得总黄酮部位。 

实施例4本发明中药黄酮提取物的提取纯化 

取400千克菟丝子和32千克红花，加入2592千克pH值为6.3的80%乙醇浸泡1小时后，回流3小时，8层纱布过滤，药渣用3456千克pH值为6.3的80%乙醇回流4小时；减压浓缩到密度为1.3g/ml，用沸程30-60℃石油醚等体积萃取5次脱脂，用乙酸乙酯等体积萃取3次， 旋转蒸发萃取液，干燥后得到粉末，为粗提黄酮部位。 

采用HPD450大孔吸附树脂，以0.2g提取物/ml的上样液浓度上样，分别用8倍（与湿树脂量相比）蒸馏水洗去杂质，然后用70%乙醇洗脱纯化总黄酮，收集洗脱液，减压回收乙醇，减压浓缩、干燥得总黄酮部位。 

实施例5建立总黄酮测定方法 

1）试剂与仪器 

聚酰胺粉乙醇（分析纯），甲醇（分析纯） 

芦丁标准溶液：称取5.0mg芦丁，加甲醇溶解并定容至100mL，即得50μg/mL。 

2）操作方法 

试样处理：称取一定量的试样，加乙醇定容至25mL，摇匀后，超声提取20min，放置，吸取上清液1.0mL，于蒸发皿中，加1g聚酰胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱。先用20mL苯洗，苯液弃去，然后用甲醇洗脱黄酮，定容至25mL。此液于波长286nm测定吸收值。同时以芦丁为标准品，测定标准曲线，求回归方程，计算试样中总黄酮含量芦丁标准曲线：吸取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL比色管中，加甲醇至刻度，摇匀，于波长286nm比色。求回归方程，计算试样中总黄酮含量。 

计算和结果表示（计算结果保留二位有效数字） 

$>X=\frac{A\times V_2\times 100}{V_1\times M\times 1000}$>

式中：X－试样中总黄酮的含量，mg/100g；A－由标准曲线算得被测液中黄酮量，μg；M－试样质量，g；V1－测定用试样体积，mL；V2－试样定容总体积，mL。 

实施例6粗提黄酮纯化工艺条件筛选 

单纯采用醇提法、热水浸提法或碱提法都无法得到高含量的黄酮，复方的提取液或粗提物必须经过分离纯化后才能提高纯度，纯化方法有重结晶法、聚酰胺吸附柱色谱法和大孔吸附树脂法，此外还有超滤法、高效液相色谱法(HPLC)和毛细血管电泳法等。工业上常规采用大孔吸附树脂法。 

1）材料与试剂 

HPD600、HPD480、HPD700、HPD750、HPD480大孔树脂（河北沧州宝恩化工有限公司）； 

D101大孔树脂（中国药科大学） 

2）应用大孔吸附树脂对粗黄酮进行纯化 

研究了大孔吸附树脂对黄酮的吸附和解吸性能，从中筛选出适合于本发明黄酮部位纯化的树脂，并运用所选定的大孔吸附树脂对黄酮部位进行纯化。 

树脂的预处理 

将大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡24h后湿法装柱；待树脂装好后，用乙醇2 BV/h通过树脂层，至流出液加水不呈白色浑浊为止，并用去离子水以同样流速洗至无乙醇；然后用2 BV 0.5%HCl溶液以2.5 ml/min流速通过树脂层，并浸泡2-4h后用水以同样流速洗至流出液pH值呈中性;最后用2 BV 2%NaOH溶液以2.5ml/min流速通过树脂层，并浸泡2-4 h后，用水以同样流速洗至流出液pH呈中性。 

不同型号树脂技术指标 

我们选用的几种型号大孔吸附树脂的技术指标详见表1。 

表1不同型号大孔吸附树脂技术指标 

3静态吸附实验 

分别称取各型号树脂各1.0g(干重)，放入250ml三角瓶中，准确加入本发明实施例1中粗提黄酮部位提取液100ml，置于水浴振荡器中，在温度为40℃、振荡频率为100Hz/min条件下，振荡12h，充分吸附后，过滤，取滤液测其浓度。按下式计算各树脂在室温下的吸附量(Q,mg/g)，测定数据详见表2。 

_0r

式中：C₀为吸附前黄酮的浓度(mg/ml)；C_r为吸附后黄酮的浓度(mg/ml)；V为样品溶液体积(ml)；W为树脂质量(g)。 

表2大孔树脂对黄酮的静态吸附性能比较 

可见静态吸附量大小排列为：HPD700〉HPD750〉D101〉HPD480〉HPD450〉HPD600。 

结合表1和表2可见：非极性的树脂对本复方黄酮的静态吸附量高于极性树脂。大孔树脂表面特有的多孔网状结构使其对有机物具有分子筛效应，即有机物可通过树脂的孔径扩散到树脂孔内表面而被吸附。树脂的孔径大小直接影响不同大小分子的自由出入，从而使树脂具有一定的选择性。因此，大孔树脂的吸附能力与被吸附物质的分子量和构型有关。 

静态解吸实验 

准确称取充分饱和吸附粗提黄酮后的各型号树脂，分别加入30%,50%,70%和90%乙醇溶液各30ml。放入水浴振荡器中振荡12h，过滤，测定滤液中黄酮含量，根据下式计算各树脂的解吸率，测定数据详见表18。 

解吸率(%)=C*V/Q*W*100 

式中:C为解吸液中黄酮的浓度(mg/ml)；V为洗脱液的体积(ml)；Q为树脂吸附量(mg/g)；W为所用树脂的质量(g,湿重) 

表3大孔树脂对黄酮的静态解吸性能比较 

由以上数据分析，可见乙醇溶液对黄酮的解吸能力随着乙醇浓度的增加而增大；而相同浓度的乙醇溶液对吸附在树脂上的黄酮的解吸能力为：HPD450〉HPD750〉HPD700〉D101〉HPD480〉HPD600。 

  结论：由不同型号的大孔树脂对黄酮静态吸附及解吸能力的分析可见，此六种大孔树脂对黄酮的静态吸附量相差不大，但解吸能力就相差较大，只有HPD450和HPD750解吸能力较强，能达到80%以上。 

动态吸附实验 

装柱时，始终保持树脂浸没在蒸馏水中，避免气泡产生对黄酮分离纯化的影响。树脂加到预 定的柱体积后，再用蒸馏水反复过柱，使柱内的树脂充分压紧。装好的树脂柱静止放置过夜，使柱内的树脂继续压紧直至充分稳定下来后才能使用。上样时将柱上部蒸馏水放至与树脂面基本齐平后，沿管壁从柱上部缓慢加入待分离纯化的样品溶液。应注意不要冲松表层树脂而使之浮才起。自柱下放出少许液体，至样品液面与树脂表面基本齐平。然后加入洗脱剂，流速控制在3-4ml/min，分段收集洗脱液，测定其中的黄酮浓度，绘制洗脱曲线。 

由静态吸附和静态解吸实验优选出HPD450和HPD750两种型号的树脂，我们就对此两种型号树脂进行动态吸附实验比较。以90%乙醇溶液作为洗脱剂，对吸附在HPD450和HPD750树脂上的黄酮进行洗脱，每间隔30ml收集洗脱液，测定不同洗脱液组分中黄酮的浓度，具体数据见表4。可以看出，HPD450树脂的洗脱曲线峰形尖锐、拖尾现象不明显，表明用90%乙醇作为洗脱剂能使吸附在HPD450树脂上的黄酮快速而集中地洗脱下来，进一步显示了HPD450树脂对黄酮良好的解吸性能。 

表4两种大孔树脂对黄酮的动态解吸 

6上样液浓度的考察 

取3份处理好的树脂HPD450各10g，分别装入2cm×20cm的柱内，取一定量的粗提黄酮部位以不同量的纯水超声使其完全溶解，配成浓度分别为0.2g提取物/ml，0.1g提取物/ml，0.05g提取物/ml的样品液，分别完全上样，收集流出液，同时用20ml蒸馏水冲洗树脂缝隙间未吸附的黄酮样品液，收集，HPLC测定其黄酮的含量，计算饱和吸附量，结果见表5。 

表5上样液浓度考察结果 

上样液浓度(g提取物/ml)0.2 0.1 0.05 上样液峰面积4990524.5 201393 16 17558314 上样液中黄酮量（g）0.52737939 0.42564905 0.37109899 流出液峰面积4607545.5 5902886 8508222 流出液中黄酮量（g）0.09738153 0.12475885 0.08991161 树脂重（g）10.005 10.006 10.011 黄酮吸附量(mg/g树脂)42.98 30.07 28.09

上样液浓度越大，吸附效果越好，但在实验过程中发现配制0.2g提取物/ml样品液时就已很难溶解，需要长时间的超声才能溶解，再增加上样液的浓度就不能使其全部溶解了，所以我们认为0.2g提取物/ml的上样液浓度为最佳浓度（其中黄酮的浓度为15.33mg/ml）。 

．吸附流速的考察 

取粗体黄酮水溶液（黄酮的浓度为15.33mg/ml）34.4ml，分别上样于6根10gHPD450大孔树 脂，分别以2、4、5、6、8ml/min的流速进行动态吸附，以黄酮的含量为指标，测定吸附后的浓度，计算饱和吸附量，结果见表6。 

表6吸附流速的考察 

吸附速度（ml/min）上样浓度(mg/ml)上样后浓度（mg/ml）上样体积（ml）饱和吸附量（mg/g）     2    15.331    5.616    34.4    33.392     4    15.331    4.933    34.4    35.741     5    15.331    4.552    34.4    37.036     6    15.331    6.280    34.4    31.102     8    15.331    12.055    34.4    11.259

结果表明，在流速为2，4，5ml/min时，吸附的效果差别很小，而增加到6ml/min以上时，吸附量随流速的增加开始下降，所以本实验最终以5ml/min为吸附流速。 

水洗量的考察 

在大孔树脂纯化过程中，由于在水洗去糖过程中有黄酮的损失，故需要对其进行考察。取化橘红水溶液（黄酮的浓度为15.33mg/ml）15ml（保证几乎没有上样造成的泄漏），上样于处理好的2cm×20cm的HPD450（10g）上，充分吸附12h后用去离子水洗脱，每10ml为一单位，利用α-萘酚浓硫酸进行显色反应，同时测定流出液中黄酮的含量。结果见表7。 

表7水洗量的考察 

水洗量(ml)α-萘酚浓硫酸显色反应颜色反应结果流出液中黄酮的浓度（mg/ml) 0~10深紫色色环反应阳性-  10~20深紫色色环反应阳性0.0013  20~30较深紫色色环反应阳性0.0120  30~40紫色色环反应阳性0.0124  40~50紫色色环反应阳性0.0339  50~60浅紫色色环反应阳性0.0414  60~70无色环反应阴性0.0540  70~80无色环反应阴性0.0940 蔗糖溶液深紫色色环反应阳性  纯水无色环反应阴性 

结果显示，70ml水洗后糖反应阴性，黄酮随着水洗量的增加而开始流失，为了保证糖反应阴性以及在保证黄酮损失较小的情况下，多去除一些水溶性杂质，水洗脱量定为80ml，即8倍上样量体积，此水洗过程中黄酮的损失为1.08%。 

故最终确定：采用HPD450大孔吸附树脂，以0.2g提取物/ml的上样液浓度上样，分别用8倍（与湿树脂量相比）蒸馏水洗去杂质，然后用70%乙醇洗脱纯化总黄酮，收集洗脱液，减压回收乙醇，减压浓缩、干燥得总黄酮部位。 

实施例7不同提取化学部分对离体卵巢颗粒细胞活性的影响 

样品制备：样品1：按本发明实施例1中得到的纯化后的总黄酮部位；样品2：按本发明实施例1中柱层析步骤之前得到的粗黄酮部分。 

动物实验方法：取22-27日龄雌性大鼠，常规饲养48h后颈椎脱臼法处死，无菌摘取大鼠的双侧卵巢，将卵巢破碎使颗粒细胞释放，用2mL含青霉素和链霉素的DMEM-F12培养液中稀释，并轻轻吹打，使其分散成单个细胞。离心过滤收集颗粒细胞。（1）MTT法：将一定浓度细胞悬液接种于24孔板，每孔80μl，每孔再加120μl培养液调整细胞密度至200μl/孔，每组设6个平行孔。将其置于5%CO₂培养箱中培养24h。取CO₂培养箱内培养了24h的颗粒细胞悬液，每孔先后加入造模浓度氯化镉和1mg·mL^-1不同样品，平行设定正常对照组（生理盐水）和模型组（氯化镉和生理盐水）。常规培养20h后于每孔中加入MTT溶液（5mg·mL^-1）20μL继续培养4h，每孔加入80μL的三联液，过夜培养，选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度，结果见表8。（2）放射免疫法：将一定浓度细胞悬液接种于24孔板，每孔80μl，每孔再加120μl培养液调整细胞密度至200μl/孔，每组设6个平行孔。将其置于5%CO₂培养箱中培养24h。取CO₂培养箱内培养了24h的颗粒细胞悬液，每孔先后加入造模浓度氯化镉和1mg·mL^-1不同样品，平行设定正常对照组（生理盐水）和模型组（氯化镉和生理盐水）。将其置于5%CO₂培养箱中培养24h。离心取其细胞上清液，用放免试剂盒测定E₂、P的含量，结果见表8。（3）流式细胞术：同法取得卵巢颗粒细胞后，将一定浓度细胞培养于培养瓶中，先后加入造模浓度氯化镉和1mg·mL^-1不同样品与培养瓶中，平行设定正常对照组（生理盐水）和模型组（氯化镉和生理盐水），24小时后消化取得细胞悬液进行流式细胞仪检测（见图1），分析给药与卵巢颗粒细胞的凋亡关系。 

MTT法和放射免疫法结果显示模型组与正常对照组在细胞增殖活性及雌孕激素分泌能力上均有显著性差异（p<0.01），可见造模成功。而相同剂量下，样品1与样品2在细胞增殖活性上作用相当，但样品1雌孕激素分泌能力强于样品2，但均与模型组有显著性差异（均p<0.01）。 

表8不同提取化学部分对离体卵巢颗粒细胞活性的影响（n=6） 

 组别  阳性对照组  样品1  样品2  模型组  正常对照组  MTT吸收度(A)  0.435±0.091^**  0.415±0.024^**  0.414±0.061^**  0.233±0.064^ΔΔ  0.465±0.093  雌激素（pmol/L)  83.89±5.33^**  81.29±1.86^**  76.36±2.51^**  36.19±1.98^ΔΔ  101.85±6.38  孕激素（nmol/L)  0.38±0.06  0.59±0.02^**  0.50±0.04^*  0.36±0.03^ΔΔ  0.69±0.07

^*P<0.05，^**P<0.01vs模型组.^ΔP<0.05，^△△P<0.01vs正常对照组 

流式细胞术结果显示：附图1中，UL代表死细胞，UR代表晚期凋亡，LL代表活细胞，LR代表早期凋亡，UR+LR为凋亡总值。图1A（正常对照组）凋亡值为7.30，图1B（模型组）凋亡值为56.42，图1C（阳性对照组）凋亡值为27.02，图1D（样品1组）凋亡值为26.30，图1E（样品2组）凋亡值为33.64，根据数值可见样品1与阳性药（戊酸雌二醇）对卵巢颗粒细胞的抗凋亡作用相当，强于样品2。 

综合卵巢颗粒细胞增殖效果、雌孕激素分泌水平及卵巢颗粒细胞的抗凋亡作用，可见样品1即纯化后的黄酮部位的各项作用活性俱佳，纯化工艺是必要的。 

实施例8本发明中药黄酮提取物对多囊卵巢综合征模型大鼠的影响 

24d龄未成年SD雌性大鼠，体重30-40g，0.5mg18-甲基炔诺酮日1次皮下注射，在27d龄时，加用HCG 1.5IU日2次皮下注射，共注射21d。造模成功后，随机分为模型组、样品1-4（纯化后的黄酮部位，制备分别同本发明实施例1-4）组及阳性药组（二甲双胍0.018g/d），每组各10只，另取45d龄SD雌性大鼠10只为正常对照组，每天灌胃1次，正常对照组和模型组给予等容积生理盐水，连续给药15天后，末次给药后取血检测血清中FSH、LH、T浓度，结果见表9。结果显示模型组与正常对照组均有显著性差异（p<0.01），灌服阳性药、本发明（高低剂量）15天后FSH、LH、T水平均与模型组有不同显著性的差异。 

表9本发明组和对照组血清中FSH、LH、T浓度的比较（n=10） 

^*P<0.05，^**P<0.01vs模型组.^ΔP<0.05，^△△P<0.01vs正常对照组 

实施例9本发明中药黄酮提取物对卵巢早衰大鼠性激素水平的影响 

采用9d龄SD雌性大鼠，连续腹腔注射14天环磷酰胺8mg/（kg·d）造模。造模成功后，随机分为模型组、样品1-4（纯化后的黄酮部位，制备分别同本发明实施例1-4）组及阳性药组（倍美力0.075mg/kg），每组各10只，另取23d龄SD雌性大鼠10只为正常对照组，每天灌胃1次，正常对照组和模型组给予等容积生理盐水，连续给药35天后，末次给药后取血检测血清中FSH、E₂浓度，结果见表10。结果显示模型组与正常对照组均有显著性差异（p<0.01），灌服阳性药、本发明（高低剂量）35天后FSH、E₂水平均与模型组有不同显著性的差异。 

表10本发明组和对照组血清中FSH、E₂浓度的比较（n=10） 

^*P<0.05，^**P<0.01vs模型组.^ΔP<0.05，^△△P<0.01vs正常对照组 。