AIM作为生物标志物在诊断、预后和治疗监测类风湿关节炎中的用途

摘要

本发明属于生物技术领域，具体提供了AIM作为生物标志物在诊断、预后和治疗监测类风湿关节炎中的用途，AIM作为生物标志物用于制备或筛选类风湿关节炎诊断试剂，不仅可用于疾病的早期诊断，还能反映疾病的严重程度。

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，特别是涉及一种AIM作为生物标志物在诊断、预后和治疗监测类风湿关节炎中的用途。

背景技术

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以侵蚀关节为主要表现的慢性自身免疫性疾病。该疾病通常通过侵蚀软骨和破坏骨骼关节导致肌肉与骨骼不健全、身体机能减退及诱发共生疾病，晚期致残率较高。如不治疗或对治疗无反应，炎症和关节破坏会导致身体功能丧失，严重影响患者的生活质量，并伴随沉重的社会经济负担。

RA是一种由环境因素和遗传因素共同调控的复杂疾病，其发病原理和机制尚未明确。RA复杂的发病机制影响了其诊断和治疗。在过去的几十年中，RA的治疗虽然得到稳步改善，然而这种改善来自于健康知识的普及和就医条件的逐步优化，而不是早诊断、早治疗。

目前临床上主要根据常规炎症指标(ESR、WBC、RF、CRP、ACCP等)以及患者临床症状和X片对RA进行诊断。临床上传统的血清诊断指标包括自身抗体抗环瓜氨酸蛋白抗体(ACCP)和类风湿因子(RF)。ACCP的灵敏度约67％，在早期RA患者中更低；RF的特异度为38％-85％；两个指标联合起来具有比单一指标更好的诊断效果。然而，有研究表明ACCP和RF组合的诊断模型仅能正确鉴定54％-57％的RA患者。目前也无其他公认的诊断RA特异性和灵敏度更好的指标。因此，具有优越性能的RA的新型生物标志物还有待开发。

外周血单个核细胞中含有一系列与免疫相关的细胞，如T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞等，因此目前多数针对RA的功能组学研究是以外周血单个核细胞为研究靶细胞。血浆内蕴含着丰富的蛋白质，通过血液循环到达全身各组织、参与生命过程。在外周血单个核细胞和血浆中筛选出在RA中异常表达的基因作为生物标志物，并研制相应的辅助诊断试剂盒，将有力推动我国RA的早期诊断、预测治疗、监测复发等，具有重要的临床应用价值。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种AIM作为生物标志物在诊断、预后和治疗监测类风湿关节炎中的应用，用于解决现有技术中缺乏对类风湿关节炎进行早期特异性诊断且具有较高灵敏度的生物标志物的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供巨噬细胞凋亡抑制因子作为生物标志物在制备或筛选类风湿性关节炎诊断试剂中的用途。

本发明第二方面提供检测巨噬细胞凋亡抑制因子的存在的试剂在制备用于诊断、预后或监测类风湿性关节炎的药剂中的用途。

在本发明的一些实施例中，所述试剂用于测定体液样品中巨噬细胞凋亡抑制因子的表达量。

在本发明的一些实施例中，所述试剂通过ELISA双抗夹心法检测巨噬细胞凋亡抑制因子的表达量。

在本发明的一些实施例中，所述体液样品中巨噬细胞凋亡抑制因子的表达量与类风湿性关节炎的严重程度正相关。

在本发明的一些实施例中，所述体液样品选自血清、血浆、血液、关节液中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，所述药剂用于诊断或监测类风湿性关节炎的存在和/或过程和/或严重程度和/或预后。

如上所述，本发明的AIM作为生物标志物在制备或筛选类风湿性关节炎诊断试剂中的用途，具有以下有益效果：一方面，本发明提供了AIM可以作为RA的一个诊断指标；另一方面，本发明提供AIM可以作为评估RA严重程度的一个指标，同时也可根据AIM表达水平预测其与RA的治疗和预后相关。

附图说明

图1显示为本发明实施例1中AIM在RA患者、OA患者与健康对照组血清中的表达量检测结果图。

图2显示为本发明实施例1中血清中AIM水平在RA患者不同并发症状态下的表达量检测结果图。

图3显示为本发明实施例1中不同疾病活动度的RA患者的AIM水平对比以及AIM与DAS28评分关系相关性分析。

图4显示为本发明实施例3的ROC曲线图。

图5显示为本发明实施例4中正常对照组小鼠、RA模型组小鼠与重组AIM作用后的小鼠血清中AIM的水平对比结果图。

图6显示为本发明实施例4中RA小鼠注射AIM重组蛋白前后血液中ESR、CRP和RA的表达变化情况。

图7显示为本发明实施例5中RA患者联合治疗前后血清中的AIM浓度检测结果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

本发明是在国家自然科学基金委员会(项目批准号：81901582)的资助下完成的。

本发明重点探究AIM在类风湿关节炎中的应用价值。巨噬细胞凋亡抑制因子AIM也被称为CD5L，是一种隶属于清道夫受体超家族的糖蛋白，主要由成熟的组织型巨噬细胞分泌。其分子量约为54kDa。AIM在血液中的浓度较高，且以与IgM结合的五聚体形式稳定存在。AIM最初被发现具有抑制巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞凋亡，支持其存活的作用。目前，越来越多的研究显示AIM在炎症性疾病及免疫应答中可发挥重要作用。如，AIM在经过注射了脂多糖(LPS)的小鼠体内表达量显著上升，且其含量与小鼠感染的严重程度相关。在伴有系统性红斑狼疮患者血清中，AIM的水平也显著提升。但AIM在类风湿关节炎中的研究未见报道。因此，本发明通过一系列的探究发现，AIM作为一种免疫调控因子参与RA的诊断和预后，为临床提供一种新的诊断方法。

实施例1

RA患者血清中AIM蛋白浓度检测

收集2018年3月到2019年3月重庆医科大学附属第一医院诊治的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)患者(按照美国风湿病协会纳入标准)血液为试验组，同期骨关节炎(osteoarthritis，OA)患者为疾病对照组，健康体检者(healthy controls，HC)为健康对照组，受试者所有研究均经重庆医科大学第一附属医院科学与伦理委员会批准。

收集110例成人类风湿关节炎患者(RA)、38例骨关节炎患者(OA)和50例健康体检者(HC)的血清样本(其统计信息如表1所示)，将血清样本置于1400×g离心7min，之后冻存在﹣80℃，用ELISA试剂盒(购自My Biosource Inc.,San Diego,CA公司，产品名称HumanOncostatin M ELISA Kit，货号ab215543)检测血清标本中AIM的表达量，操作方法严格按照试剂盒所附说明书进行。用SPSS 19.0软件做统计学分析，GraphPad Prism7.0软件作图。

表1 RA患者、OA患者及健康体检者数据统计表

图1显示为AIM在RA患者、OA患者与健康体检者血清中的表达量检测结果图。

如图1所示，AIM水平在RA患者中明显高于OA患者和健康体检者，且具有统计学差异(P＜0.05)。

在110例RA患者中，有24例RA患者同时患有RA相关的代谢综合征(RA-associatedmetabolic syndrome，RA-MS)，21例RA患者同时患有RA相关的间质性肺炎(RA-associatedinterstitial lung disease，RA-ILD)，65例RA患者没有患有任何并发症。对比不同并发症状态下的RA患者的血清样本中的AIM浓度，结果如图2所示。从图2中可以看出，AIM水平在患有并发症的RA患者中明显高于没有患有任何并发症的RA患者，且RA-ILD组的RA患者的血清中的AIM水平高于RA-MS组的RA患者，差异具有统计学意义(P＜0.05)，这与CRP,RF等炎症指标在RA-MS组和RA-ILD组差异同步。

同时，将110例RA患者根据类风湿关节炎病情活动度评价(DAS28评分)分为低度活动组(low activity group)、中度活动组(moderare activity group)和高度活动组(highactivity group)，其临床特征统计信息如表2所示。

表2不同疾病活动度的RA患者的临床特征统计表

注：IQR：interquartile range，四分位距；WBC：white blood cells，白细胞；Hb：hemoglobin，血红蛋白；TC：total cholesterol，总胆固醇；TG：triglycerides，甘油三酯；HDL-c：high-density lipoprotein cholesterol，高密度脂蛋白胆固醇；LDL-c：low-density lipoprotein cholesterol，低密度脂蛋白胆固醇；APOA：apolipoprotein A，载脂蛋白A；APOB：apolipoprotein B，载脂蛋白B；T28：Tender joint count in 28joints，患者28个关节压痛计数；SW28：swollen joint count in 28joints，患者28个关节肿胀计数；ESR：erythrocyte sedimentation rate，血沉；CRP：C-reactive protein，C反应蛋白；RF：rheumatoid factors，类风湿因子；AKA：anti-keratin antibodies，抗角蛋白抗体；Anti-CCP：anti-cyclic cirullinated peptide antibodies，抗环瓜氨酸肽抗体。

*Bold values indicate statistical significance,p-value<0.05。

对比分析不同临床疾病活动度的RA患者血清中的AIM水平，并进行AIM与DAS28评分关系相关性分析，结果如图3所示。从图3可以看出，随着疾病活动度的增加，RA患者血清中的AIM水平也增加，且AIM含量与临床疾病活动度DSA28评分呈正相关。

以上结果说明，AIM可以作为RA的诊断指标并可反映疾病的严重程度，且与疾病的严重程度正相关。

实施例2

ROC曲线分析比较血清AIM对RA的诊断效能

通过检验科LIS系统收集实施例1中的110例RA患者的实验室指标ESR、RA、CRP、ACCP的检测值，用相关性分析判断AIM和ESR、RF、CRP、ACCP在RA中的诊断价值，通过SPSS19.0软件绘制ROC曲线，并用MedCalc 15.8软件比较ROC曲线下面积的统计学差异。

结果如图4所示，图4中，各项指标的ROC曲线下面积分别是：AIM为0.865(95％CI,0.781-0.949)、ESR为0.819(95％CI,0.704-0.914)、RF为0.642(95％CI,0.513-0.770)、CRP为0.790(95％CI,0.687-0.892)和ACCP为0.714(95％CI,0.599-0.830)，可以看出，生物标志物AIM所覆盖的曲线下面积明显大于ESR、RF、CRP和ACCP，且具有统计学意义(P<0.001)。上述结果说明AIM可以作为RA的诊断指标，且其诊断效果优于传统炎症指标(ESR、RF、CRP)和ACCP。

实施例3

小鼠RA模型的建立

为证实上述结果，我们参照经典方法构建了福氏诱导的RA小鼠模型。具体实施过程如下：

实验动物：健康6-8w雄性C57BL/6小鼠(SPF级)，体质量(20±2)g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，饲养于重庆医科大学实验动物中心SPF级实验室，实验前适应性喂养7d。动物实验均严格遵循中华人民共和国科技部颁布的实验室动物照料及使用指南，符合重庆医科大学实验动物伦理会管理规定。实验动物许可证号：SCKK(渝)2012-0001。

实验方法：用小牛软骨Ⅱ型胶原(CII,Chondrex,Redmond,Washington,USA)加福氏完全佐剂(CFA,Sigma)充分乳化后作为造模剂，通过皮下注射于小鼠足跖部，14天后同样方法二次加强注射，致炎20天后小鼠四肢严重肿胀，踝关节直径、脚爪体积增大，血清TNF-a水平升高，关节软骨坏死脱落、纤维化，关节腔狭窄，足爪X-ray评价，综合以上，得到临床评分≥3分(按美国风湿病协会(ACR)制定的临床评分规则评分)，证明RA小鼠模型造模成功。

实施例4

RA小鼠模型体内AIM含量的检测

实验方法：将实验动物被随机分为3组：①正常对照组，②RA组：按照实施例3所示的方法建立RA小鼠，③RA+anti-AIM组：先按照实施例3所示的方法建立RA小鼠模型，然后予以AIMR(CD36)单克隆抗体(R&D公司)干预，每隔2小时注射一次，共6h，在注射完AIMR(CD36)单克隆抗体后，检测实验动物血液中TNF-a结果，血清中TNF-a的检测方法可按试剂盒(Endogen公司生产的大鼠TNF-a检验试剂盒)说明书进行。注射后7、14、20天(①②③为对应时相点)观察RA大鼠相关性行为变化(如：心率、呼吸变化等)，保证其生命体征正常。

将小鼠麻醉处理死，用电子数显卡尺测量踝关节直径，用足爪仪测量足爪体积；从胫骨下端内、外踝上缘连线处切断，称量包括踝关节在内的整个足爪的重量；用小鼠踝关节直径和最后的足爪重量来计算关节炎严重程度。并将小鼠足爪置于福尔马林固定液中固定至少24h，然后脱钙1周，进行组织病理学检查；脱钙完全后，将整个踝关节石蜡包埋后纵向切为两片，苏木精-伊红染色(HE染色)以评价炎症水平和骨破坏，甲苯胺蓝染色以评价软骨改变，并用ELASH法检测FLS细胞(大鼠关节成纤维样滑膜细胞)裂解液中确定的炎症因子(ESR、CRP、RF)表达以及RA大鼠血液中TNF-α和AIM的表达水平。

实验结果：

血液TNF-α结果：正常对照组小鼠血液中的TNF-a的浓度约为67.2(43-90.8)ng/L，RA组小鼠血液中的TNF-α的浓度约为276.1(103-386.2)ng/L，RA+anti-AIM组小鼠血液中的TNF-a的浓度约为156(115-238.2)ng/L，说明AIM在RA中有促进炎症的作用。

血清中AIM水平结果：图5显示为正常对照组小鼠、RA模型小鼠与重组AIM作用后的小鼠血清中AIM的水平对比结果图，从图5可知，小鼠在发病后可引起RA小鼠血液中的AIM含量升高，且差异具有统计学意义(P<0.001)。

FLS细胞中炎症因子表达结果：图6显示为RA小鼠注射AIM重组蛋白前后血液中ESR(血沉)、CRP(C反应蛋白)和RF(类风湿因子)的表达变化情况，从图6可知，给予了外源性的重组AIM处理后的RA小鼠血液中的CRP、ESR和RF含量均高于未经AIM处理的RA组小鼠，提示AIM组RA小鼠炎症损伤更严重，且差异具有统计学意义(P<0.001)。

上述结果表明，AIM的高表达会加速机体的炎症病理损伤。因此，AIM的高表达可以作为评估RA疾病严重程度的一个指标。

实施例5

从实施例1中挑选24名具有中高疾病活动的RA患者，经过拉米夫定片和激素联合治疗8周后，采集治疗前、治疗后患者的血清标本，通过ELISA试剂盒检测血清中的AIM浓度，统计信息如表3。

表3 8周联合治疗前后RA患者血清中的AIM与临床指标的相关性统计表

注：T28：患者28个关节压痛计数；SW28：患者28个关节肿胀计数；ESR：血沉；WBC：白细胞；Neutrophile：中性粒细胞；HB(HGB)：血红蛋白；PLT：血小板；CRP：C反应蛋白；RF：rheumatoid factor，类风湿因子；Anti-CCP：Anti-cyclic citrullinated peptideantibodies，抗环瓜氨酸肽抗体；RA33：anti-RA 33antibody，抗类风湿蛋白；DAS28：the28-joint DiseaseActivity Score，关节受累活动度评分。

通过t检验分析数据，用SPSS 19.0软件做统计学分析，GraphPad Prism7.0软件作图，结果如图7所示。从图7中可以得出，经过8周有效的联合治疗后，RA患者血清中增高的AIM浓度明显降低，且差异具有统计学意义(P<0.0001)。说明AIM可以作为RA治疗过程中的监测指标。

综上所述，本发明发现AIM在临床RA患者血清中的含量显著高于健康体检者，且重症患者表现出更高的含量，与炎症指标ESR、CRP、ACCP、RF显著相关，并通过ROC曲线分析发现AIM作为分子生物标志物在RA的诊断上具有较高的效益。之后通过动物实验发现RA模型小鼠体内同样出现AIM水平升高的情况，并且与疾病的严重性呈正相关。因此，本发明提供AIM作为诊断类风湿关节炎和评估其预后的指标。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。