一种用于贲门腺癌早期筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒

摘要

本发明属于肿瘤医学技术领域，具体公开了一种用于贲门腺癌早期筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，该试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由Dock10、IVL、CDH1和P53组成。进一步地，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、显色液、终止液和洗涤液。本发明的ELISA试剂盒可以有效检测贲门腺癌，尤其是早期贲门腺癌，其检测灵敏度高达87.5%，特异性达到了75%，可用于贲门腺癌高发区无症状人群的大规模筛查，有利于无症状高危人群贲门腺癌筛查和早期发现。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和肿瘤学领域，具体涉及一种用于贲门腺癌早期筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒。

背景技术

中国北部，尤其是河南省林州及其毗邻的辉县、安阳、磁县等地是世界上贲门腺癌发病率和死亡率最高的地区。由于贲门腺癌的发病机制不清，同时缺乏针对贲门腺癌的早期检测敏感指标和有效的检查手段，大部分患者在被确诊时，疾病已经发展至中晚期，预后极差。早期贲门腺癌的5年生存率可达90％以上，而中晚期患者的5年生存率仅10％左右。目前，贲门腺癌仍然是该地区肿瘤相关主要死亡原因之一，对当地居民的健康和生活造成了巨大的威胁。

内镜普查、贲门粘膜活检等组织病理学检查是确诊早期贲门腺癌的主要方法之一，但由于这些检查成本高、操作复杂、耗时长，且会给被检查者带来一定的创伤和或不适，极大地限制了这些方法在高发区大规模无症状人群和高危人群中的应用。因而，寻找有效的贲门腺癌特异性分子诊断标志物用于筛选贲门腺癌高风险人群，对贲门腺癌的早发现、早治疗，进而提高贲门腺癌患者的生存和预后具有重要意义。

贲门腺癌的发生是由多种抑癌基因和癌基因共同参与，并与环境因素交互作用的多阶段演进的过程。癌细胞在其发生和发展过程中会合成并释放出一组其特有的分泌性抗原，即肿瘤相关抗原(Tumor-associated Antigen,TAA)，因而患者的血清中可能会存在这些抗原相对应的自身抗体。有关肝癌和结肠癌的一些研究已经表明，应用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)方法检测患者体内的自身抗体有助于高危人群的预警和筛查。同时相关研究表明，肿瘤具有异质性，即使同一肿瘤也可能有不同的抗原表达，目前人们尚未找到针对某一肿瘤的单一分子标志物。因此，与单个自身抗体检测方法相比，用多个肿瘤相关抗原来联合检查患者体内自身抗体的表达情况，有利于提高针对某一肿瘤的检出率。然而，针对贲门腺癌早期诊断的多种自身抗体联合检测方法以及相应试剂盒的应用还比较少见。

本研究采用应用蛋白组学技术筛选出4种肿瘤相关抗原，4种肿瘤相关抗原分别为Dock10、IVL、CDH1和P53，并且发现这4种肿瘤相关抗原的自身抗体在早期贲门腺癌患者中就可以检测到，并有较高的特异性和敏感性。Dock基因家族在肿瘤中的突变和表达异常的现象比较普遍，Dock10基因突变可能会造成蛋白质结构异常，从而影响其蛋白表达量，并造成功能异常。外皮蛋白(Involucrin，IVL)是交联包膜的蛋白前体，在多种肿瘤中呈高表达状态，在肿瘤的诊断中发挥重要作用。CDH1是Ca²⁺依赖性细胞粘附分子，是钙粘蛋白家族中作用最为重要且研究最为深入的跨膜糖蛋白，其主要功能是介导同型细胞间特异性粘附，并在维持上皮组织结构和功能中发挥重要作用。CDH1被认为是一种肿瘤抑制基因，参与多种上皮来源的恶性肿瘤的发生、发展和侵袭，在乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、甲状腺癌中均发现其表达异常，并被认为是一种肿瘤转移抑制因子。P53基因作为一种转录因子，是最早发现的抑癌基因之一，其所表达的P53蛋白在调节细胞凋亡过程中起重要作用，具有明显的抑癌作用，研究已经证实，大多数恶性肿瘤的发生都与P53的突变有关。4种TAA的P53已有文献报道与贲门腺癌的早期诊断有关，但是Dock10、IVL、CDH1在诊断贲门腺癌的应用中还未见文献报道。应用Dock10、IVL、CDH1和P53这4种TAA来检测贲门腺癌患者血清中相应自身抗体的表达也未见报道。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种用于贲门腺癌早期筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

肿瘤相关抗原Dock10、IVL、CDH1和P53的组合在制备用于贲门腺癌筛查的试剂盒中的应用。

一种用于贲门腺癌早期筛查的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由Dock10、IVL、CDH1和P53组成。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。更加优选地，所述样品稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述第二抗体稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述显色液由显色液A和显色液B组成，所述显色液A为0.02％(W/V)TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)，所述显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；所述终止液为2mol/L的浓硫酸；所述洗涤液为含0.2％吐温20的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述第二抗体带有可检测的标记物。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述标记物为辣根过氧化物酶。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述第二抗体为RecA蛋白。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述阳性对照血清为P53阳性对照血清，所述阴性对照血清为P53阴性对照血清。更加优选地，所述P53阳性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体均为阳性的贲门腺癌患者血清，所述P53阴性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体表达水平均为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。大量研究已明确表明P53抗原在贲门腺癌的发生发展过程中起十分重要的调节作用，并且P53抗体在贲门腺癌患者血清中具有较高的表达。本发明选择P53抗体阳性血清作为阳性对照，P53抗体阴性血清作为阴性对照，阳性对照血清和阴性对照血清是经过精心筛选出来的血清，同一ELISA试剂盒的其他抗原抗体反应的强弱可以据此作为参照，达到质控的目的。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述固相载体为酶标板。更加优选地，所述酶标板为96孔酶标板(共8行12列)，所述96孔酶标板按照精心设计的布局图(参见图2)包被Dock10、IVL、CDH1和P53这4种肿瘤相关抗原，其中每行包被有一种抗原，每种抗原包被于11个点样孔中。同一检测对象的血清样品经过稀释后加入该96孔酶标板同一列的连续4个孔内(如第1列中的A-D孔、第1列中的E-H孔、第2列中的A-D孔、第2列中的E-H孔，以此类推)，该ELISA测试剂盒可同时用于检测22个待测血清样品中4种肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平，可进行大规模的样品检测。所述96孔酶标板第12列中设有空白对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔，所述空白对照孔中包被不含抗原的包被液，所述阳性对照孔和阴性对照孔中均包被P53抗原。

根据上述的自身抗体联合检测ELISA试剂盒，优选地，所述自身抗体联合检测ELISA试剂盒的检测对象为人类血清。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：

(1)本发明首次将Dock10、IVL、CDH1和P53这4种TAA作为一个组合，联合检测人血清中上述4种TAA的抗体表达水平，可以有效检测贲门腺癌，尤其是早期贲门腺癌，其检测灵敏度高达87.5％(即早期贲门腺癌患者中应用这4个肿瘤相关抗原进行诊断时被正确的诊断为早期贲门腺癌的比率为87.5％)，特异性达到了75％(即非贲门腺癌患者用4种肿瘤相关抗原联合检测时，被确定为未患贲门腺癌者的比率为75％)，远高于现有临床内镜筛查贲门腺癌的检出率，因此，本发明的ELISA试剂盒具有较高的灵敏度和特异度，可用于贲门腺癌高发区无症状人群的大规模筛查，能够大大提高早期贲门腺癌的检出率，有利于无症状高危人群筛查和早期发现，从而大大降低了贲门腺癌患者的死亡率，为贲门腺癌患者和家庭带来极大的福祉。

(2)本发明制备的ELISA试剂盒可同时检测血清样品中4种TAA抗体的表达水平，与4种TAA抗体的单独检测相比，4种TAA抗体联合检测，检出成功率高，技术重现性好，耗材少，成本低，操作简单，使用方便、快捷，极大地提高了临床贲门腺癌的检测效率和诊断效率，能够在普通实验室推广使用。

附图说明

图1为间接酶联免疫吸附实验原理图。

图2为本发明ELISA试剂盒中96孔酶标板的抗原包被布局图(其中，抗原名称代表了该孔包被了此抗原，加入的是待测血清，用来检测待测血清中相应抗体的表达水平；“+”代表阳性对照孔，加入的是阳性对照血清；“-”代表阴性对照孔，加入的是阴性对照血清；“空”代表空白对照孔，该孔加入不含血清的样本稀释液，其它操作均相同，该空白对照用于反应实验过程中的背景值)。

图3为4种TAA自身抗体在对照组和早期贲门腺癌组中的阳性率结果图。

图4为4种TAA自身抗体检测早期贲门腺癌的ROC曲线图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明作进一步详细说明，但并不限制本发明的范围。

下列实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明根据间接酶联免疫法的原理制备了一种可用于早期贲门腺癌筛查和诊断的自身抗体联合检测ELISA试剂盒。间接酶联免疫法的原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相抗原-受检抗体复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，然后测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量(参见图1)。

实施例1：试剂盒的制备

1、实验材料及试剂：

(1)4种肿瘤相关抗原蛋白(Dock10、IVL、CDH1和P53)，购买于武汉艾美捷科技有限公司；

(2)96孔酶标板：3590(costar.美国)；

(3)包被液：50mM碳酸盐缓冲液，pH＝9.6；

(4)封闭液：含2％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(5)样品稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(6)第二抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(7)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白(Invitrogen公司)；

(8)洗涤液：含0.2％吐温20的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；

(9)阳性对照血清：P53阳性对照血清，即使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体均为阳性的贲门腺癌患者血清；

(10)阴性对照血清：P53阴性对照血清，即使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清；

(11)显色液A：0.02％(W/V)TMB，配制：取甲基联苯胺(TMB)0.005g，溶解于25ml去离子水中；

(12)显色液B：0.006％(W/V)过氧化脲素，配制：取柠檬酸4.665g、Na2HPO418.40g，充分溶解于400ml去离子水中，加0.75％过氧化氢脲素3.2ml，调整pH值至5.0-5.5，加去离子水定容至终体积500ml，混匀4℃保存；

(13)终止液：2mol/L的硫酸；

(14)酶标仪：Star Fax 2100(Awareness.美国)。

2.制备抗原包被的酶标板：

(1)制备4种肿瘤相关抗原溶液：

将4种肿瘤相关抗原蛋白分别溶解于包被液中，充分混匀，配制成浓度均为0.5μg/μL的4种抗原溶液。

(2)包被酶标板：

将制备好的4种肿瘤相关抗原溶液按照图2所示的布局分别加入到96孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔；阳性对照孔和阴性对照孔中加入p53抗原溶液，空白对照孔加入包被液，37℃恒温培养箱孵育1h，4℃过夜后去除包被液，然后用洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min。

(3)封闭：

向包被后的96孔酶标板的点样孔中加入封闭液(加样量为300μl/孔)，室温孵育2小时，然后除去封闭液。

(4)干燥，包装：

将封闭处理后的96孔酶标板放置37℃烘干箱烘干后，包装，得到抗原包被的96孔酶标板，4℃保存备用。

3.本发明试剂盒的组成如下：

(1)步骤2制备的抗原包被的96孔酶标板；

(2)样品稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(3)第二抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(4)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白(Invitrogen公司)；

(5)显色液：显色液由显色液A和显色液B组成，其中，显色液A为0.02％(W/V)TMB，显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；使用时将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀；

(6)终止液：2mol/L的硫酸；

(7)洗涤液：含0.2％吐温20的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；

(8)阳性对照血清：P53阳性对照血清；

(9)阴性对照血清：P53阴性对照血清。

试剂(2)-(9)分别包装后与抗原包被的96孔酶标板构成试剂盒。

实施例2：试剂盒的使用方法

1.血清样本孵育：

将待检测的血清样本用样品稀释液按1：500的比例进行稀释，然后将稀释后的血清样本加入已包被抗原的96孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min。

2.酶标二抗孵育：

将辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白用第二抗体稀释液按1：40000的比例进行稀释，然后将稀释后的辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白加入96孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育50min，然后弃去点样孔中液体，用洗涤液洗涤3次，每次3min。

3.显色及终止反应：

将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，然后将混合后的显色液迅速加入96孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃避光反应15min，然后向每个反应孔中再加入50μl终止液，终止反应，于20分钟内用酶标仪器读取OD450光密度值，并用空白对照孔调零。

4.结果判定：

以阴性对照孔所测OD值得平均数加两个标准差(Mean+2SD)为截断值(cut-off值)，反应孔中OD值读数大于等于截断值的判断为阳性，反应孔中OD值读数小于截断值的判断为阴性。

实施例3：本发明试剂盒的诊断价值分析

用本发明实施例1所述的试剂盒的检测早期贲门腺癌患者和正常人的血清样本，以评估和分析本发明试剂盒用于早期贲门腺癌筛查和诊断的价值。

1.样本来源

收集来自郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点开放实验室160份血清样本，其中正常人血清80份(对照组)，早期贲门腺癌患者血清80份(早期贲门腺癌组)。80例正常人血清来自该实验室合作医院体检中心的健康体检人群，无任何肿瘤相关的证据。80例正常人中，男性43例，女性37例，平均年龄58.9±6.3岁，年龄范围40-70岁。80份早期贲门腺癌患者血清来源于经组织病理学证实的早期(0期+I期)贲门腺癌患者，均未接受放疗或化疗治疗。80例贲门腺癌患者中，男性51例，女性29例，平均年龄58.5±7.0岁，年龄范围45-75岁。

2.血清制备

抽取空腹静脉血5ml至离心管中，室温中静置30分钟，离心(2000转/min)，吸取上层血清分装，每管100μl，-80℃冰箱储存。

3.实验方法

采用本发明的实施例1制备的试剂盒和实施例2所述的试剂盒的使用方法对80例正常人群血清(对照组)和80例贲门腺癌患者血清(贲门腺癌组)中4种TAA自身抗体的含量进行检测。以实施例2步骤4中的结果判断标准为标准，分别计算贲门腺癌组和对照组中4种肿瘤相关抗原自身抗体的阳性率(每组中检测出的阳性对象例数除以该组被检测对象总例数即为阳性率)(参见表1)，并应用Excel软件绘制4种肿瘤相关抗原自身抗体在早期贲门癌组和对照组中阳性率的柱形图(参见图3)；应用SPSS22.0软件进行统计学检验，采用两独立样本卡方检验方法比较贲门腺癌组和对照组抗体阳性率，检验水准α＝0.05，当P＜0.05时，结果具有统计学意义，然后采用筛检试验的评价方法评价自身抗体检测贲门腺癌的诊断价值(结果参见表2和图4)。

4.结果分析

表1对照组和贲门腺癌组中4种TAA自身抗体的表达情况

注：n代表样本总数，N代表抗体阳性数，％代表抗体阳性率。

由表1和图3可知，在对照组中，4种TAA自身抗体的阳性表达率均比较低，而在早期贲门腺癌组中，4种TAA自身抗体的阳性表达率均比较高，而且经过统计学检验，4种TAA自身抗体在早期贲门腺癌组中的阳性表达率均明显高于对照组，由此证明，Dock10、IVL、CDH1和P53这4种TAA自身抗体可用于早期贲门腺癌的检测，具有早期诊断的价值。

表2不同肿瘤相关抗原TAA自身抗体组合联合检测结果

由表2可知，随着抗原数目的增加，早期贲门腺癌患者血清中，肿瘤相关抗原自身抗体的阳性率由37.5％增加至87.5％，其检测的敏感度由37.5升高至87.5％，当4种TAA组合时，检测的敏感度达到了87.5％，也就是说贲门腺癌患者中应用该方法能够正确的诊断为贲门腺癌的百分比为87.5％。虽然随着抗原数目的增加，检测特异度逐渐降低，但当4种肿瘤相关抗原组合时，其特异度仍然能够达到75.0％，这一结果表明非贲门腺癌患者采用4种肿瘤相关抗原联合检测时，被正确的诊断为未患贲门腺癌的百分比为75.0％；因此，使用Dock10、IVL、CDH1和P53这4种肿瘤相关抗原组合进行早期贲门腺癌诊断，可以在保证诊断特异度的前提下大幅度的提高诊断的灵敏度。此外，约登指数在统计学中是指敏感度和特异度之和减去1，其数值范围是0-1，约登指数越接近于1，其诊断价值越大，表明该方法的应用价值越高。随着抗原数目的增加，约登指数在不断增大且逐渐趋向于1，表明4种肿瘤相关抗原组合用于诊断和筛查早期贲门腺癌的方法具有较好的诊断价值。因此，采用Dock10、IVL、CDH1和P53这4种肿瘤相关抗原的自身抗原联合检测待测血清中相应自身抗体表达水平的方法，既能保持较高的特异度又能提高诊断的敏感度，对评估待测对象患贲门腺癌的风险具有很好的诊断和应用价值。

由图4可知，应用4种肿瘤相关抗原联合检测早期贲门腺癌患者血清中的自身抗体时，ROC曲线下的面积为0.781，说明使用该ELISA试剂盒和检测方法对早期贲门腺癌的诊断具有较高的灵敏性和特异度，该试剂盒和方法适合进行早期贲门腺癌的诊断和筛查。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。