一种聚肌胞的制备方法

摘要

本发明公开了一种聚肌胞的制备方法，属于生物医药技术领域。首先利用肌苷二磷酸制备聚肌苷酸，胞苷二磷酸制备聚胞苷酸；再利用制备的聚肌苷酸和聚胞苷酸反应获得高纯的聚肌胞产品。本发明通过自行研制的高纯度聚肌苷酸和聚胞苷酸来制备聚肌胞，使得制备的聚肌胞纯度高，同时降低了制备过程中的处理难度。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种聚肌胞的制备方法。

背景技术

聚肌苷酸胞苷酸(简称聚肌胞，PIC)是一种安全高效的先天免疫激活剂，具有广谱抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、增强机体免疫力等多种功能，全球市场容量潜力估值为每年数百亿美元。医学临床上，可用于慢性乙型肝炎、流行性出血热、流行性乙型脑炎、病毒性角膜炎等病毒性疾病治疗，对乳腺癌、前列腺癌等肿瘤的辅助性治疗已处于III期临床实验阶段。兽医临床上，可用于口蹄疫、禽流感、猪瘟等病毒性疫病的预防和治疗，亦可提高畜禽疫苗免疫效力。聚肌胞使用方便、广泛，可以与许多药物同时使用，具有协同或相加作用。无种属特异性，可广泛在家禽、猪、牛等动物上使用，同时还具有抗病毒谱广，毒性小、安全范围大的优点。

在本领域原来聚肌胞的生产大多采用化学合成或采购半成品PI(聚肌苷酸)与PC(聚胞苷酸)，再将PI与PC物理混合的方式进行生产，存在成本高昂，不能规模化生产，生产流程不完整，分子结构不正确，终极产品质量无法保证等缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供一种聚肌胞的制备方法，该发明是通过利用肌苷二磷酸制备聚肌苷酸，胞苷二磷酸制备聚胞苷酸；再利用制备的聚肌苷酸和聚胞苷酸反应获得高纯的聚肌胞产品。

本发明的技术方案如下：

一种聚肌胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别将聚肌苷酸和聚胞苷酸的精滤液以及稳定剂加热至37℃；

(2)然后将加热后的聚肌苷酸和聚胞苷酸的精滤液以及稳定剂混合，其中聚肌苷酸和聚胞苷酸、稳定剂的重量比为1:1:1，保持37℃恒温下进行搅拌30min；

(3)将搅拌结束后的溶液进行过滤，将滤液采用乙醇进行醇沉处理，醇沉时间为0.5-1.5h；

(4)将醇沉后的物料进行离心分离，将离心后的固体产物采用乙醇浸泡脱水，真空干燥后得到聚肌胞产品，

所述聚肌苷酸精滤液是在肌苷二磷酸(简称IDP)溶液中加入MgCl₂，肌苷二磷酸和MgCl₂的摩尔比为10:1，并调整混合溶液的pH为7.0；加热聚合，在38℃下充分搅拌，并加入固化酶继续搅拌2h；聚合反应后收集反应原液，过滤后并进行清洗得到聚肌苷酸精滤液；

所述聚胞苷酸的精滤液是在胞苷二磷酸(简称CDP)溶液中加入MgCl₂，胞苷二磷酸和MgCl₂的摩尔比为10:1，并调整混合溶液的pH为7.0；加热聚合，在38℃下充分搅拌，并加入固化酶继续搅拌2h；聚合反应后收集反应原液，过滤后并进行清洗得到聚胞苷酸精滤液。

优选的，所述稳定剂为硫酸卡那霉素，聚赖氨酸，葡萄糖酸钙中的一种或几种。

优选的，所述固化酶为多核苷磷酸化酶，其加入量为0.5-1.5wt％。

优选的，所述肌苷二磷酸溶液的制备方法包括以下步骤：

1)ATP脱氨制成肌苷三磷酸溶液，将ATP中缓慢加入25-35wt％亚硝酸钠，反应6个小时后，调整pH至1.2-2.0，继续反应40个小时以上，直至不产生浓烟为反应终止,获得肌苷三磷酸溶液；

2)肌酐三磷酸溶液脱色处理,将步骤1)制备肌苷三磷酸溶液的pH调整至中性，然后加入活性炭脱色处理，过滤后即制得脱色的肌酐三磷酸溶液；

3)降解酶溶液的制备，配制浓度为50％的酵母溶液，调整其pH为6，在30℃下静置2天，过滤后得到降解酶溶液；

4)降解反应，将步骤2)脱色后的肌酐三磷酸溶液与步骤3)制备的降解酶溶液混合，混合溶液中肌酐三磷酸与降解酶的重量比为10-15:1，然后加入纯化水，调整溶液中的肌酐三磷酸浓度为2-3％，并调整溶液的pH为中性；再加入占肌酐三磷酸重量为20％的葡萄糖，充分搅拌；升温至36-37℃进行酶解，当溶液中肌酐三磷酸占总胞苷重量小于1％，反应即为终止，立即用盐酸调整溶液的pH为2；

5)将反应结束后的发酵液冷却至25℃，并加入2％的珍珠岩粉末充分搅拌，待发酵液温度降至20℃以下后过滤、柱层析处理、脱色和超滤后获得肌酐二磷酸溶液。

优选的，所述胞苷二磷酸溶液的制备方法包括以下步骤：

1)磷酸化，将200～500重量份酵母投入磷酸化反应罐中搅拌，水浴加热至30～31℃，停止加热，投入2～10重量份氯化镁、20～50重量份磷酸二氢钾、20～50重量份白糖，控制温度在31～33℃反应10～20分钟，然后加入胞苷酸30重量份，反应2-5小时，当胞苷三磷酸含量大于85％时反应完成，立即调pH至2终止反应，同时用冷冻水进行冷却；

2)层析纯化，将步骤1)冷却后磷酸化产物进行板框过滤、层析、吸附、洗涤、洗脱和脱色钠滤；

3)降解，将步骤2)层析纯化后的溶液在36～37℃，加入核苷酸降解酶进行降解，胞苷三磷酸占总胞苷小于3％时反应完成，调pH至2终止反应，同时将反应溶液冷却至20℃以下；

4)对步骤3)中冷却后的溶液依次进行板框过滤、吸附、洗涤、洗脱、脱色和超滤纳滤，即获得胞苷二磷酸溶液。

在胞苷二磷酸溶液制备过程中，所述核苷酸降解酶的加入量与步骤2)纯化后溶液中磷酸化产物的重量比为0.5-2:1。

与现有技术相比，本申请的有益效果如下：本发明是通过肌苷二磷酸IDP制备聚肌苷酸PI，胞苷二磷酸CDP制备聚胞苷酸PC；再利用制备的聚肌苷酸PI和聚胞苷酸PC反应获得高纯的聚肌胞PIC产品。在制备PI和PC过程中，通过调整工艺手段，有效除去PI和PC产品中的内毒素、残留DNA及残余宿主菌体蛋白等杂质，在PI和PC聚合过程中降低了生产难度，有利于杂质的除去，利用所制备的PI和PC使得本发明制备的PIC为结构稳定的双链核糖核苷酸聚肌胞产品，大大提高了产品纯度和有效成分的含量。

具体实施例方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种聚肌胞的制备方法，包括以下步骤：

1、制备胞苷二磷酸CDP溶液

1)磷酸化，将300重量份酵母投入磷酸化反应罐中搅拌，水浴加热至31℃，停止加热，投入5重量份氯化镁、30重量份磷酸二氢钾、20重量份白糖，控制温度在31℃反应20分钟，然后加入胞苷酸30重量份，反应3小时，当胞苷三磷酸含量大于85％时反应完成，立即调pH至2终止反应，同时用冷冻水进行冷却；

2)层析纯化，将步骤1)冷却后磷酸化产物进行板框过滤、层析、吸附、洗涤、洗脱和脱色钠滤；

3)降解，将步骤2)层析纯化后的溶液在37℃，加入核苷酸降解酶进行降解，所述核苷酸降解酶的加入量与步骤2)纯化后溶液中磷酸化产物的重量比为1:1，胞苷三磷酸占总胞苷小于3％时反应完成，调pH至2终止反应，同时将反应溶液冷却至20℃以下；

4)对步骤3)中冷却后的溶液依次进行板框过滤、吸附、洗涤、洗脱、脱色和超滤纳滤，即获得胞苷二磷酸溶液。

2、制备肌酐二磷酸IDP溶液

1)将ATP中缓慢加入30wt％亚硝酸钠，反应6个小时后，调整pH至1.2，继续反应40个小时以上，直至不产生浓烟为反应终止，获得肌苷三磷酸溶液；

2)肌酐三磷酸溶液脱色处理,将步骤1)制备肌苷三磷酸溶液的pH调整至中性，然后加入活性炭脱色处理，过滤后即制得脱色的肌酐三磷酸溶液；

3)降解酶溶液的制备，配制浓度为50％的酵母溶液，调整其pH为6，在30℃下静置2天，过滤后得到降解酶溶液；

4)降解反应，将步骤2)脱色后的肌酐三磷酸溶液与步骤3)制备的降解酶溶液混合，混合溶液中肌酐三磷酸与降解酶的重量比为13:1，然后加入纯化水，调整溶液中的肌酐三磷酸浓度为2％，并调整溶液的pH为中性；再加入占肌酐三磷酸重量为20％的葡萄糖，充分搅拌；升温至36-37℃进行酶解，当溶液中肌酐三磷酸占总胞苷重量小于1％，反应即为终止，立即用盐酸调整溶液的pH为2；

5)将反应结束后的发酵液冷却至25℃，并加入2％的珍珠岩粉末充分搅拌，待发酵液温度降至20℃以下后过滤、柱层析处理、脱色和超滤后获得肌酐二磷酸溶液。

3、利用胞苷二磷酸制备聚胞苷酸精滤液

在步骤1制备的胞苷二磷酸溶液中加入MgCl₂，胞苷二磷酸和MgCl₂的摩尔比为10:1，并调整混合溶液的pH为7.0；

加热聚合，在38℃下充分搅拌，并加入固化酶，所述固化酶为多核苷磷酸化酶，其加入量为1.0wt％，加入后继续搅拌2h；

聚合反应后收集反应原液，过滤后并进行清洗得到聚胞苷酸精滤液；

4、利用肌苷二磷酸制备聚肌苷酸精滤液

在步骤2制备的肌苷二磷酸溶液中加入MgCl₂，肌苷二磷酸和MgCl₂的摩尔比为10:1，并调整混合溶液的pH为7.0；

加热聚合，在38℃下充分搅拌，并加入固化酶，所述固化酶为多核苷磷酸化酶，其加入量为0.5wt％，加入后继续搅拌2h；

聚合反应后收集反应原液，过滤后并进行清洗得到聚肌苷酸精滤液。

5、利用聚胞苷酸精滤液和聚肌苷酸精滤液制备聚肌胞

分别将步骤3制备的聚胞苷酸的精滤液和步骤4制备的聚肌苷酸精滤液以及硫酸卡那霉素稳定剂加热至37℃；

然后将加热后的聚肌苷酸和聚胞苷酸的精滤液以及稳定剂混合，其中聚肌苷酸和聚胞苷酸、稳定剂的重量比为1:1:1，保持37℃恒温下进行搅拌30min；

将搅拌结束后的溶液进行过滤，将滤液采用乙醇进行醇沉处理，醇沉时间为1.0h；

将醇沉后的物料进行离心分离，将离心后的固体产物采用乙醇浸泡脱水，真空干燥后得到聚肌胞产品。

实施例2

一种聚肌胞的制备方法，包括以下步骤：

1、制备胞苷二磷酸CDP溶液

1)磷酸化，将200重量份酵母投入磷酸化反应罐中搅拌，水浴加热至30℃，停止加热，投入2重量份氯化镁、20重量份磷酸二氢钾、20重量份白糖，控制温度在31℃反应10分钟，然后加入胞苷酸30重量份，反应2小时，当胞苷三磷酸含量大于85％时反应完成，立即调pH至2终止反应，同时用冷冻水进行冷却；

2)层析纯化，将步骤1)冷却后磷酸化产物进行板框过滤、层析、吸附、洗涤、洗脱和脱色钠滤；

3)降解，将步骤2)层析纯化后的溶液在36℃，加入核苷酸降解酶进行降解，所述核苷酸降解酶的加入量与步骤2)纯化后溶液中磷酸化产物的重量比为1:1，胞苷三磷酸占总胞苷小于3％时反应完成，调pH至2终止反应，同时将反应溶液冷却至20℃以下；

4)对步骤3)中冷却后的溶液依次进行板框过滤、吸附、洗涤、洗脱、脱色和超滤纳滤，即获得胞苷二磷酸溶液；

2、制备肌苷二磷酸IDP溶液

将ATP中缓慢加入25wt％亚硝酸钠，反应6个小时后，调整pH至1.2，继续反应40个小时以上，直至不产生浓烟为反应终止,获得肌苷三磷酸溶液；

2)肌酐三磷酸溶液脱色处理,将步骤1)制备肌苷三磷酸溶液的pH调整至中性，然后加入活性炭脱色处理，过滤后即制得脱色的肌酐三磷酸溶液；

3)降解酶溶液的制备，配制浓度为50％的酵母溶液，调整其pH为6，在30℃下静置2天，过滤后得到降解酶溶液；

4)降解反应，将步骤2)脱色后的肌酐三磷酸溶液与步骤3)制备的降解酶溶液混合，混合溶液中肌酐三磷酸与降解酶的重量比为10:1，然后加入纯化水，调整溶液中的肌酐三磷酸浓度为2％，并调整溶液的pH为中性；再加入占肌酐三磷酸重量为20％的葡萄糖，充分搅拌；升温至36-37℃进行酶解，当溶液中肌酐三磷酸占总胞苷重量小于1％，反应即为终止，立即用盐酸调整溶液的pH为2；

5)将反应结束后的发酵液冷却至25℃，并加入2％的珍珠岩粉末充分搅拌，待发酵液温度降至20℃以下后过滤、柱层析处理、脱色和超滤后获得肌酐二磷酸溶液。

3、利用胞苷二磷酸制备聚胞苷酸精滤液

在步骤1制备的胞苷二磷酸溶液中加入MgCl₂，胞苷二磷酸和MgCl₂的摩尔比为10:1，并调整混合溶液的pH为7.0；

加热聚合，在38℃下充分搅拌，并加入固化酶，所述固化酶为多核苷磷酸化酶，其加入量为1.5wt％，加入后继续搅拌2h；

聚合反应后收集反应原液，过滤后并进行清洗得到聚胞苷酸精滤液；

4、利用肌苷二磷酸制备聚肌苷酸精滤液

在步骤2制备的肌苷二磷酸溶液中加入MgCl₂，肌苷二磷酸和MgCl₂的摩尔比为10:1，并调整混合溶液的pH为7.0；

加热聚合，在38℃下充分搅拌，并加入固化酶，所述固化酶为多核苷磷酸化酶，其加入量为1.0wt％，加入后继续搅拌2h；

聚合反应后收集反应原液，过滤后并进行清洗得到聚肌苷酸精滤液

5、利用聚胞苷酸精滤液和聚肌苷酸精滤液制备聚肌胞

分别将步骤3制备的聚胞苷酸的精滤液和步骤4制备的聚肌苷酸精滤液以及聚赖氨酸稳定剂加热至37℃；

然后将加热后的聚肌苷酸和聚胞苷酸的精滤液以及稳定剂混合，其中聚肌苷酸和聚胞苷酸、稳定剂的重量比为1:1:1，保持37℃恒温下进行搅拌30min；

将搅拌结束后的溶液进行过滤，将滤液采用乙醇进行醇沉处理，醇沉时间为1.5h；

将醇沉后的物料进行离心分离，将离心后的固体产物采用乙醇浸泡脱水，真空干燥后得到聚肌胞产品。

实施例3

一种聚肌胞的制备方法，包括以下步骤：

1、制备胞苷二磷酸CDP溶液

1)磷酸化，将500重量份酵母投入磷酸化反应罐中搅拌，水浴加热至31℃，停止加热，投入10重量份氯化镁、50重量份磷酸二氢钾、50重量份白糖，控制温度在33℃反应20分钟，然后加入胞苷酸30重量份，反应5小时，当胞苷三磷酸含量大于85％时反应完成，立即调pH至2终止反应，同时用冷冻水进行冷却；

2)层析纯化，将步骤1)冷却后磷酸化产物进行板框过滤、层析、吸附、洗涤、洗脱和脱色钠滤；

3)降解，将步骤2)层析纯化后的溶液在36℃，加入核苷酸降解酶进行降解，所述核苷酸降解酶的加入量与步骤2)纯化后溶液中磷酸化产物的重量比为0.5:1，胞苷三磷酸占总胞苷小于3％时反应完成，调pH至2终止反应，同时将反应溶液冷却至20℃以下；

4)对步骤3)中冷却后的溶液依次进行板框过滤、吸附、洗涤、洗脱、脱色和超滤纳滤，即获得胞苷二磷酸溶液；

2、制备肌苷二磷酸IDP溶液

1)将ATP中缓慢加入35wt％亚硝酸钠，反应6个小时后，调整pH至1.8，继续反应40个小时以上，直至不产生浓烟为反应终止,获得肌苷三磷酸溶液；

2)肌酐三磷酸溶液脱色处理,将步骤1)制备肌苷三磷酸溶液的pH调整至中性，然后加入活性炭脱色处理，过滤后即制得脱色的肌酐三磷酸溶液；

3)降解酶溶液的制备，配制浓度为50％的酵母溶液，调整其pH为6，在30℃下静置2天，过滤后得到降解酶溶液；

4)降解反应，将步骤2)脱色后的肌酐三磷酸溶液与步骤3)制备的降解酶溶液混合，混合溶液中肌酐三磷酸与降解酶的重量比为15:1，然后加入纯化水，调整溶液中的肌酐三磷酸浓度为3％，并调整溶液的pH为中性；再加入占肌酐三磷酸重量为20％的葡萄糖，充分搅拌；升温至36-37℃进行酶解，当溶液中肌酐三磷酸占总胞苷重量小于1％，反应即为终止，立即用盐酸调整溶液的pH为2；

5)将反应结束后的发酵液冷却至25℃，并加入2％的珍珠岩粉末充分搅拌，待发酵液温度降至20℃以下后过滤、柱层析处理、脱色和超滤后获得肌酐二磷酸溶液。。

3、利用胞苷二磷酸制备聚胞苷酸精滤液

在步骤1制备的胞苷二磷酸溶液中加入MgCl₂，胞苷二磷酸和MgCl₂的摩尔比为10:1，并调整混合溶液的pH为7.0；

加热聚合，在38℃下充分搅拌，并加入固化酶，所述固化酶为多核苷磷酸化酶，其加入量为0.8wt％，加入后继续搅拌2h；

聚合反应后收集反应原液，过滤后并进行清洗得到聚胞苷酸精滤液；

4、利用肌苷二磷酸制备聚肌苷酸精滤液

在步骤2制备的肌苷二磷酸溶液中加入MgCl₂，肌苷二磷酸和MgCl₂的摩尔比为10:1，并调整混合溶液的pH为7.0；

加热聚合，在38℃下充分搅拌，并加入固化酶，所述固化酶为多核苷磷酸化酶，其加入量为1.2wt％，加入后继续搅拌2h；

聚合反应后收集反应原液，过滤后并进行清洗得到聚肌苷酸精滤液

5、利用聚胞苷酸精滤液和聚肌苷酸精滤液制备聚肌胞

分别将步骤3制备的聚胞苷酸的精滤液和步骤4制备的聚肌苷酸精滤液以及葡萄糖酸钙稳定剂加热至37℃；

然后将加热后的聚肌苷酸和聚胞苷酸的精滤液以及稳定剂混合，其中聚肌苷酸和聚胞苷酸、稳定剂的重量比为1:1:1，保持37℃恒温下进行搅拌30min；

将搅拌结束后的溶液进行过滤，将滤液采用乙醇进行醇沉处理，醇沉时间为0.8h；

将醇沉后的物料进行离心分离，将离心后的固体产物采用乙醇浸泡脱水，真空干燥后得到聚肌胞产品。

本发明实施例1-3制备的聚肌胞产品进行XRD检测，三种产品在265.5nm处均有最强吸收峰，在229.5nm处均有最小吸收峰，满足市场需求。

同时本发明所制备的聚肌胞产品放置6-12月，其增色效应没有发生明显改变，具有较强的稳定性。

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。