公开/公告号CN110144011A
专利类型发明专利
公开/公告日2019-08-20
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申请/专利权人 上海洛启生物医药技术有限公司;
申请/专利号CN201810152107.6
申请日2018-02-14
分类号
代理机构上海一平知识产权代理有限公司;
代理人刘妍珺
地址 201321 上海市浦东新区芙蓉花路500弄10号楼201室
入库时间 2024-02-19 12:22:45
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-03-21
专利权质押合同登记的注销 IPC(主分类):C07K16/42 授权公告日:20200623 申请日:20180214 专利号:ZL2018101521076 登记号:Y2022310000036 出质人:上海洛启生物医药技术有限公司 质权人:杭州银行股份有限公司上海分行 解除日:20230303
专利权质押合同登记的生效、变更及注销
2022-03-15
专利权质押合同登记的生效 IPC(主分类):C07K16/42 专利号:ZL2018101521076 登记号:Y2022310000036 登记生效日:20220224 出质人:上海洛启生物医药技术有限公司 质权人:杭州银行股份有限公司上海分行 发明名称:针对T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3的单域抗体 申请日:20180214 授权公告日:20200623
专利权质押合同登记的生效、变更及注销
2020-06-23
授权
授权
2019-09-13
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K16/42 申请日:20180214
实质审查的生效
2019-08-20
公开
公开
技术领域
本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，公开了针对T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim3)的单域抗体及其编码序列和应用。
背景技术
肿瘤细胞的识别、肿瘤抗原被呈递给T细胞、T细胞激活及特异性杀伤肿瘤细胞。在这个过程中，T细胞的激活需要协同刺激信号，而这些信号需要“免疫检查点”的调控。T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin and mucin3，TIM3)作为人体重要的免疫检查点，在肿瘤微环境中的免疫调节中起着至关重要的作用。
TIM3是TIM家族成员，编码含有281个氨基酸的Ⅰ型膜蛋白。TIM分子的共同结构包括:免疫球蛋白N末端V区、黏蛋白结构域、跨膜区和胞内区。其胞外部分包括一个富含半胱氨酸的免疫球蛋白样区域和一个富含苏氨酸、丝氨酸和脯氨酸的黏蛋白区，胞浆区具有6个酪氨酸，其中1个属于酪氨酸磷酸化基序部分。在免疫球蛋白可变区由4个半胱氨酸组成的高度保守的不同于其他免疫球蛋白超家族成员的独特裂隙:它可以与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。TIM3选择性地表达在分泌IFN-γ的T辅助细胞(Th1和Th17)、T调控细胞(Treg)、树突状细胞(DCs)、单核细胞、肥大细胞、NK细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)上，在肿瘤细胞上亦有表达，如黑色素瘤、胃癌、B细胞淋巴瘤。
TIM3分子在免疫细胞上广泛表达，可与细胞表面的半乳糖凝集素-9(galectin-9，Gal-9)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PtdSer)、高迁移率族蛋白B-1(highmobility group box-1，HMGB-1)等多个配体结合，参与调节多种T细胞包括调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)的分化，在免疫自稳与凋亡细胞的清除过程中发挥着重要作用。TIM3在免疫耐受的形成和维持中有重要作用，TIM3可诱导CD8+T细胞“耗竭”，还可通过诱导凋亡的方式抑制Th1和Th17细胞生长，下调Th1和Th17型免疫反应，促进Treg分化，增强Treg抑制作用。除此之外，Tim3通过调节巨噬细胞的活化及功能，抑制组织破坏性免疫应答，在自身免疫性疾病中发挥重要的调节作用。作为肿瘤免疫应答的负调控因子，TIM3具有很明显的肿瘤药物开发潜力，已发展为免疫治疗与药物开发领域热门的靶点分子。但是，仍然需要开发具有良好结合性能的抗体药物。
发明内容
本发明提供了29株特异性针对TIM3的纳米抗体，同时提供纳米抗体的编码序列、制备方法。
在本发明的第一方面，本发明提供了T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3(TIM3)特异性纳米抗体的CDR区。
在一些实施方案中，所述TIM3纳米抗体包含一个特异性结合TIM3的免疫球蛋白单一可变结构域。在一些实施方案中，所述TIM3纳米抗体包含两个或更多个特异性结合TIM3的免疫球蛋白单一可变结构域。
在一些实施方案中，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含选自以下的CDRl、CDR2和CDR3:
(1)SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2，SEQ ID NO:3所示的CDR3(对应于抗体株1的CDR)；
(2)SEQ ID NO:4所示的CDR1，SEQ ID NO:5所示的CDR2，SEQ ID NO:6所示的CDR3(对应于抗体株2的CDR)；
(3)SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:8所示的CDR2，SEQ ID NO:9所示的CDR3(对应于抗体株3的CDR)；
(4)SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:11所示的CDR2，SEQ ID NO:12所示的CDR3(对应于抗体株4的CDR)；
(5)SEQ ID NO:13所示的CDR1，SEQ ID NO:14所示的CDR2，SEQ ID NO:15所示的CDR3(对应于抗体株5的CDR)；
(6)SEQ ID NO:16所示的CDR1，SEQ ID NO:17所示的CDR2，SEQ ID NO:18所示的CDR3(对应于抗体株6的CDR)；
(7)SEQ ID NO:19所示的CDR1，SEQ ID NO:20所示的CDR2，SEQ ID NO:21所示的CDR3(对应于抗体株7的CDR)；
(8)SEQ ID NO:22所示的CDR1，SEQ ID NO:23所示的CDR2，SEQ ID NO:24所示的CDR3(对应于抗体株8的CDR)；
(9)SEQ ID NO:25所示的CDR1，SEQ ID NO:26所示的CDR2，SEQ ID NO:27所示的CDR3(对应于抗体株9的CDR)；
(10)SEQ ID NO:28所示的CDR1，SEQ ID NO:29所示的CDR2，SEQ ID NO:30所示的CDR3(对应于抗体株10的CDR)；
(11)SEQ ID NO:31所示的CDR1，SEQ ID NO:32所示的CDR2，SEQ ID NO:33所示的CDR3(对应于抗体株11的CDR)；
(12)SEQ ID NO:34所示的CDR1，SEQ ID NO:35所示的CDR2，SEQ ID NO:36所示的CDR3(对应于抗体株12的CDR)；
(13)SEQ ID NO:37所示的CDR1，SEQ ID NO:38所示的CDR2，SEQ ID NO:39所示的CDR3(对应于抗体株13的CDR)；
(14)SEQ ID NO:40所示的CDR1，SEQ ID NO:41所示的CDR2，SEQ ID NO:42所示的CDR3(对应于抗体株14的CDR)；
(15)SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:44所示的CDR2，SEQ ID NO:45所示的CDR3(对应于抗体株15的CDR)；
(16)SEQ ID NO:46所示的CDR1，SEQ ID NO:47所示的CDR2，SEQ ID NO:48所示的CDR3(对应于抗体株16的CDR)；
(17)SEQ ID NO:49所示的CDR1，SEQ ID NO:50所示的CDR2，SEQ ID NO:51所示的CDR3(对应于抗体株17的CDR)；
(18)SEQ ID NO:52所示的CDR1，SEQ ID NO:53所示的CDR2，SEQ ID NO:54所示的CDR3(对应于抗体株18的CDR)；
(19)SEQ ID NO:55所示的CDR1，SEQ ID NO:56所示的CDR2，SEQ ID NO:57所示的CDR3(对应于抗体株19的CDR)；
(20)SEQ ID NO:58所示的CDR1，SEQ ID NO:59所示的CDR2，SEQ ID NO:60所示的CDR3(对应于抗体株20的CDR)；
(21)SEQ ID NO:61所示的CDR1，SEQ ID NO:62所示的CDR2，SEQ ID NO:63所示的CDR3(对应于抗体株21的CDR)；
(22)SEQ ID NO:64所示的CDR1，SEQ ID NO:65所示的CDR2，SEQ ID NO:66所示的CDR3(对应于抗体株2的CDR)；
(23)SEQ ID NO:67所示的CDR20，SEQ ID NO:68所示的CDR2，SEQ ID NO:69所示的CDR3(对应于抗体株23的CDR)；
(24)SEQ ID NO:70所示的CDR1，SEQ ID NO:71所示的CDR2，SEQ ID NO:72所示的CDR3(对应于抗体株24的CDR)；
(25)SEQ ID NO:73所示的CDR1，SEQ ID NO:74所示的CDR2，SEQ ID NO:75所示的CDR3(对应于抗体株25的CDR)；
(26)SEQ ID NO:76所示的CDR1，SEQ ID NO:77所示的CDR2，SEQ ID NO:78所示的CDR3(对应于抗体株26的CDR)；
(27)SEQ ID NO:79所示的CDR1，SEQ ID NO:80所示的CDR2，SEQ ID NO:81所示的CDR3(对应于抗体株27的CDR)；
(28)SEQ ID NO:82所示的CDR1，SEQ ID NO:83所示的CDR2，SEQ ID NO:84所示的CDR3(对应于抗体株28的CDR)；
(29)SEQ ID NO:85所示的CDR1，SEQ ID NO:86所示的CDR2，SEQ ID NO:87所示的CDR3(对应于抗体株29的CDR)。
在另一优选例中，所述的CDR1、CDR2和CDR3由VHH链的框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
本发明第二方面，提供了一种TIM3特异性纳米抗体的VHH链，其够特异性结合Tim3，且VHH链包括框架区FR和权利要求1所述的CDR区中的一种或多种。
在另一优选例中，所述抗体中的VHH链选自SEQ ID NO:88-116中的一种或多种。
在另一优选例中，所述纳米抗体为纳米抗体组合，其中所述特异性纳米抗体组合至少包含SEQ ID NO:114所示的序列。
在另一优选例中，本发明的TIM3特异性纳米抗体还涵盖能够与由SEQ ID NO:88-116中任一的氨基酸序列组成的VHH结合TIM3上的相同表位的抗TIM3抗体分子。
本发明第三方面，提供了一种分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：本发明第一方面所述的抗TIM3纳米抗体的CDR区、本发明第二方面所述的抗TIM3纳米抗体的VHH链、本发明第十三方面所述VHH链组合或本发明抗TIM3纳米抗体。
在另一优选例中，所述多核苷酸序列为组合形式，优选地，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:117-145中的一种或多种。
在另一优选例中，本发明涉及编码本发明的TIM3纳米抗体的核酸分子。本发明的核酸可为RNA、DNA或cDNA。
本发明第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体表达本发明第三方面的多核苷酸。
本发明第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第五方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第四方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞。
本发明第六方面，提供了一种产生抗TIM3纳米抗体的方法，包括步骤：
(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗TIM3纳米抗体的培养物；以及
(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗TIM3纳米抗体；及任选的
(c)纯化和/或修饰步骤(b)所获得的TIM3纳米抗体。
在另一优选例中，所述的抗TIM3纳米抗体具有如SEQ ID NO:88-116所示的氨基酸序列。
本发明第七方面，提供了一种结合物，所述结合物含有：
(a)如本发明第二方面所述的抗TIM3纳米抗体的VHH链、或如本发明第二方面所述的抗TIM3纳米抗体；和可操作性连接的
(b)选自下组的修饰标记：化学标记和生物标记。
在另一优选例中，所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物。
在另一优选例中，所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。
本发明还提供了一种偶联物，所述偶联物由本发明第二方面所述抗TIM3纳米抗体或本发明第七方面结合物与固体介质或半固体介质偶联制得。
在另一优选例中，所述偶联物由本发明第七方面结合物与选自以下的偶联元件构成：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
在另一优选例中，所述偶联物含有：多价(如二价)的如本发明第二方面所述的TIM3纳米抗体、如本发明第三方面所述的TIM3纳米抗体的VHH链。
在另一优选例中，所述多价是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本发明第二方面所述的TIM3纳米抗体、如本发明第三方面所述的TIM3纳米抗体的VHH链。
本发明第八方面，提供了本发明第二方面所述的TIM3纳米抗体的用途，用于制备(a)用于检测TIM3分子的试剂；(b)用于治疗肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。
本发明第九方面，提供了一种药物组合物，含有：
(i)本发明第一方面抗TIM3纳米抗体VHH链的互补决定区CDR、本发明第二方面所述的VHH链、本发明第十三方面VHH组合、本发明第二方面所述的抗TIM3纳米抗体或其抗原结合片段中的一种或多种；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
本发明第十方面，提供了本发明第二方面所述抗TIM3纳米抗体的一种或多种的用途：
(i)用于检测人TIM3分子；
(ii)用于流式检测；
(iii)用于细胞免疫荧光检测；
(iv)用于治疗肿瘤；
(v)用于肿瘤诊断。
在另一优选例中，所述用途为非诊断的和非治疗的。
本发明第十一方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第二方面所述的纳米抗体的序列或如本发明第三方面所述的重链可变区VHH的序列；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签和HA标签在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合TIM3蛋白。
本发明第十二方面，提供了如本发明第二方面所述的纳米抗体、如本发明第三方面所述的VHH链、或本发明第七方面所述的免疫偶联物的用途，它们被用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中TIM3蛋白；
其中，所述药剂用于治疗或预防表达TIM3(即TIM3阳性)的肿瘤。
本发明第十三方面，还提供了一种特异性结合TIM3纳米抗体VHH链组合，其特征在于，所述VHH链组合中至少含有具有以下CDR区的VHH链：
SEQ ID NO:79所示的CDR1，SEQ ID NO:80所示的CDR2，SEQ ID NO:81所示的CDR3。
在另一优选例中，所述的VHH链组合中还含有具有以下一种或多种CDR区的VHH链：
SEQ ID NO:46所示的CDR1，SEQ ID NO:47所示的CDR2，SEQ ID NO:48所示的CDR3；
SEQ ID NO:52所示的CDR1，SEQ ID NO:53所示的CDR2，SEQ ID NO:54所示的CDR3
SEQ ID NO:58所示的CDR1，SEQ ID NO:59所示的CDR2，SEQ ID NO:60所示的CDR3；
SEQ ID NO:61所示的CDR1，SEQ ID NO:62所示的CDR2，SEQ ID NO:63所示的CDR3；
SEQ ID NO:64所示的CDR1，SEQ ID NO:65所示的CDR2，SEQ ID NO:66所示的CDR3；
SEQ ID NO:67所示的CDR1，SEQ ID NO:68所示的CDR2，SEQ ID NO:69所示的CDR3；
SEQ ID NO:70所示的CDR1，SEQ ID NO:71所示的CDR2，SEQ ID NO:72所示的CDR3；
SEQ ID NO:73所示的CDR1，SEQ ID NO:74所示的CDR2，SEQ ID NO:75所示的CDR3；
SEQ ID NO:76所示的CDR1，SEQ ID NO:77所示的CDR2，SEQ ID NO:78所示的CDR3。
在另一优选例中，所述的VHH链组合中还含有具有以下一种或多种CDR区的VHH链：
SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2，SEQ ID NO:3所示的CDR3；
SEQ ID NO:4所示的CDR1，SEQ ID NO:5所示的CDR2，SEQ ID NO:6所示的CDR3；
SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:8所示的CDR2，SEQ ID NO:9所示的CDR3；
SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:11所示的CDR2，SEQ ID NO:12所示的CDR3；
SEQ ID NO:13所示的CDR1，SEQ ID NO:14所示的CDR2，SEQ ID NO:15所示的CDR3；
SEQ ID NO:16所示的CDR1，SEQ ID NO:17所示的CDR2，SEQ ID NO:18所示的CDR3；
SEQ ID NO:19所示的CDR1，SEQ ID NO:20所示的CDR2，SEQ ID NO:21所示的CDR3；
SEQ ID NO:22所示的CDR1，SEQ ID NO:23所示的CDR2，SEQ ID NO:24所示的CDR3；
SEQ ID NO:25所示的CDR1，SEQ ID NO:26所示的CDR2，SEQ ID NO:27所示的CDR3；
SEQ ID NO:28所示的CDR1，SEQ ID NO:29所示的CDR2，SEQ ID NO:30所示的CDR3；
SEQ ID NO:31所示的CDR1，SEQ ID NO:32所示的CDR2，SEQ ID NO:33所示的CDR3；
SEQ ID NO:34所示的CDR1，SEQ ID NO:35所示的CDR2，SEQ ID NO:36所示的CDR3；
SEQ ID NO:37所示的CDR1，SEQ ID NO:38所示的CDR2，SEQ ID NO:39所示的CDR3；
SEQ ID NO:40所示的CDR1，SEQ ID NO:41所示的CDR2，SEQ ID NO:42所示的CDR3；
SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:44所示的CDR2，SEQ ID NO:45所示的CDR3；
SEQ ID NO:49所示的CDR1，SEQ ID NO:50所示的CDR2，SEQ ID NO:51所示的CDR3；
SEQ ID NO:82所示的CDR1，SEQ ID NO:83所示的CDR2，SEQ ID NO:84所示的CDR3；
SEQ ID NO:85所示的CDR1，SEQ ID NO:86所示的CDR2，SEQ ID NO:87所示的CDR3。
在另一优选例中，所述的组合至少含有Nb27的氨基酸序列；较佳地，所述组合还含有一种或多种选自Nb16，18，20，21，22，23，24，25，或26的序列；更佳地，所述组合还含有一种或多种选自Nb1-15，Nb17，Nb19，Nb28，或Nb29的序列。
本发明第十四方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明第二方面的抗TIM3纳米抗体、本发明第七方面的结合物和/或本发明偶联物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1展示的是通过梯度稀释将构建的噬菌体文库涂布于平板上，并通过计算生长单克隆数目进行库容测定。图中显示取1/5梯度稀释104倍、105倍、106倍的克隆数目，计算单克隆数并确定文库大小为9.0×108CFU。
图2是从构建的文库中随机挑取24颗克隆进行菌落PCR检测，对构建文库的插入率进行评定。附图从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为DNA分子标记，其余孔道为检测插入片段的PCR产物，PCR产物带约为500bp；经检测，该文库的插入率达到91.7％。
图3是TIM3纳米抗体筛选富集过程。经第一轮淘选后未出现富集，第二轮淘选出现7.8倍富集，第三轮淘选出现408倍富集。
图4是大肠杆菌表达29株TIM3纳米抗体的纯化图。对应SEQ ID NO:88-116氨基酸序列的纳米抗体，是经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后，TIM3纳米抗体的SDS-PAGE的电泳图。结果显示，TIM3纳米抗体经过该纯化过程，其纯度可达到90％以上。
图5是TIM-3稳转细胞株检测图，A图为TIM-3阳性抗体(处于临床Ⅰ期研究阶段的TSR-022)的蛋白纯化结果，B图为TIM-3稳转细胞株的流式检测结果。
图6是29株纳米抗体的亲和力筛选结果。以PD-1，PD-L1和CTLA-4作为阴性对照，流式检测29株TIM-3纳米抗体对TIM-3抗原的亲和力。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，成功获得一组抗TIM3纳米抗体，实验结果表明，本发明获得的29株TIM3(Nb1-29，分别对应SEQ ID NO.:88-116)纳米抗体可高特异、高亲和与TIM3结合。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明利用人源的TIM3胞外段抗原蛋白免疫骆驼，获得高质量的免疫纳米抗体基因文库。然后将TIM3蛋白分子偶联在酶标板上，展示TIM3蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了TIM3特异性的纳米抗体基因。再将此基因转至大肠杆菌中，从而获得了能在大肠杆菌中高效表达的、且特异性高的纳米抗体株。
如本文所用，术语“本发明纳米抗体”、“本发明的抗TIM3纳米抗体”、“本发明TIM3纳米抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于TIM3(包括人TIM3)的纳米抗体。特别优选的是VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:88-116所示的纳米抗体。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“单域抗体(single domain antibody，sdAb，或VHH)”、“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。
单域抗体/纳米抗体(Nanobody)作为一种新型的小分子抗体片段，由驼类天然的重链抗体重链可变区(VHH)克隆获得。Nanobody(Nb)具有优良的生物学特性，分子量12-15kDa，是完整抗体的十分之一，具有很好的组织穿透性，特异性高，水溶性好。因其特殊的结构性质，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎完美克服了传统抗体的开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷，逐渐成为新一代抗体治疗中的新兴力量，在免疫诊断和治疗中显示出广阔的应用前景。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗TIM3蛋白抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合TIM3蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有TIM3蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明序列如表2所示
表2
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；9.疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
VHH链组合
本发明还包含了一种单域抗体VHH链的组合。其中，所述组合至少含有以下CDR区：
SEQ ID NO:79所示的CDR1，SEQ ID NO:80所示的CDR2，SEQ ID NO:81所示的CDR3。
此外，所述组合还包含了优选地，所述组合至少含有2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种或29种选自下组的CDR区或选自SEQ ID NO.:88-116所示的VHH链。
优选地，
所述的VHH链组合中还含有具有以下一种或多种CDR区的VHH链：
SEQ ID NO:46所示的CDR1，SEQ ID NO:47所示的CDR2，SEQ ID NO:48所示的CDR3；
SEQ ID NO:52所示的CDR1，SEQ ID NO:53所示的CDR2，SEQ ID NO:54所示的CDR3
SEQ ID NO:58所示的CDR1，SEQ ID NO:59所示的CDR2，SEQ ID NO:60所示的CDR3；
SEQ ID NO:61所示的CDR1，SEQ ID NO:62所示的CDR2，SEQ ID NO:63所示的CDR3；
SEQ ID NO:64所示的CDR1，SEQ ID NO:65所示的CDR2，SEQ ID NO:66所示的CDR3；
SEQ ID NO:67所示的CDR1，SEQ ID NO:68所示的CDR2，SEQ ID NO:69所示的CDR3；
SEQ ID NO:70所示的CDR1，SEQ ID NO:71所示的CDR2，SEQ ID NO:72所示的CDR3；
SEQ ID NO:73所示的CDR1，SEQ ID NO:74所示的CDR2，SEQ ID NO:75所示的CDR3；
SEQ ID NO:76所示的CDR1，SEQ ID NO:77所示的CDR2，SEQ ID NO:78所示的CDR3。
更优选地，所述的VHH链组合中还含有具有以下一种或多种CDR区的VHH链：
SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2，SEQ ID NO:3所示的CDR3；
SEQ ID NO:4所示的CDR1，SEQ ID NO:5所示的CDR2，SEQ ID NO:6所示的CDR3；
SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:8所示的CDR2，SEQ ID NO:9所示的CDR3；
SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:11所示的CDR2，SEQ ID NO:12所示的CDR3；
SEQ ID NO:13所示的CDR1，SEQ ID NO:14所示的CDR2，SEQ ID NO:15所示的CDR3；
SEQ ID NO:16所示的CDR1，SEQ ID NO:17所示的CDR2，SEQ ID NO:18所示的CDR3；
SEQ ID NO:19所示的CDR1，SEQ ID NO:20所示的CDR2，SEQ ID NO:21所示的CDR3；
SEQ ID NO:22所示的CDR1，SEQ ID NO:23所示的CDR2，SEQ ID NO:24所示的CDR3；
SEQ ID NO:25所示的CDR1，SEQ ID NO:26所示的CDR2，SEQ ID NO:27所示的CDR3；
SEQ ID NO:28所示的CDR1，SEQ ID NO:29所示的CDR2，SEQ ID NO:30所示的CDR3；
SEQ ID NO:31所示的CDR1，SEQ ID NO:32所示的CDR2，SEQ ID NO:33所示的CDR3；
SEQ ID NO:34所示的CDR1，SEQ ID NO:35所示的CDR2，SEQ ID NO:36所示的CDR3；
SEQ ID NO:37所示的CDR1，SEQ ID NO:38所示的CDR2，SEQ ID NO:39所示的CDR3；
SEQ ID NO:40所示的CDR1，SEQ ID NO:41所示的CDR2，SEQ ID NO:42所示的CDR3；
SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:44所示的CDR2，SEQ ID NO:45所示的CDR3；
SEQ ID NO:49所示的CDR1，SEQ ID NO:50所示的CDR2，SEQ ID NO:51所示的CDR3；
SEQ ID NO:82所示的CDR1，SEQ ID NO:83所示的CDR2，SEQ ID NO:84所示的CDR3；
SEQ ID NO:85所示的CDR1，SEQ ID NO:86所示的CDR2，SEQ ID NO:87所示的CDR3。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合TIM3蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的纳米抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
标记的纳米抗体
在本发明的一个优选例中，所述纳米抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗TIM3的纳米抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的纳米抗体。
本发明的抗TIM3纳米抗体具有很好的特异性，很高的效价。
检测方法
本发明还涉及检测TIM3蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中TIM3蛋白的水平。
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明还提供了用于检测TIM3水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别TIM3蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
应用
如上所述，本发明的纳米抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与TIM3相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对TIM3的临床诊断和靶向治疗。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明纳米抗体高特异性针对人的具有正确空间结构的TIM3蛋白。
(b)本发明纳米抗体的亲和力强。
(c)本发明纳米抗体的生产简便。
本发明纳米抗体适合于原核表达和真核表达，具有可溶性极高，不易聚集，能耐高温、强酸、强碱等致变性条件的优点。适用于实验室及工业开发。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：人TIM3蛋白的表达纯化
(1)将人TIM3(ECD)的核苷酸序列合成在pFUSE-IgG1载体上，其中在TIM3(ECD)的C端引入一个TEV酶切位点，便于制备无Fc标签的TIM3(ECD)蛋白；
(2)用Omega质粒大提试剂盒提取构建的pFΜSE-IgG1-TIM3(ECD)质粒；
(3)培养HEK293F细胞至OD为2.0×106个/mL；
(4)将质粒与转染试剂PEI 1:3混合均匀后静置20min，然后加入到HEK293F细胞中，37℃，6％CO2摇床培养箱中培养5-6天；
(5)收集细胞上清，与Protein A珠子在室温下结合1h；
(6)用磷酸盐缓冲液pH 7.0洗涤珠子后，再用0.1M pH 3.0Glycine洗脱蛋白；
(7)将洗脱的蛋白超滤至PBS中，测定产量后取样进行SDS-PAGE对抗原纯度进行检测，其余蛋白保存于-80℃冰箱；
(8)选取纯度大于90％的抗原进行后续骆驼的免疫。
实施例2：TIM3噬菌体文库的构建
(1)将1mg TIM3(ECD)-Fc抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共免疫7次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；
(2)7次免疫结束后，提取100mL骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；
(3)合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH；
(4)利用限制性内切酶Pst I及Not I酶切20μg pMECS噬菌体展示载体(Biovector供应)及10μg VHH并连接两个片段；
(5)将连接产物转化至电转感受态细胞TG1中，构建TIM3纳米抗体文库并测定库容，库容大小为9.0×108CFU(图1)；
与此同时，随机挑取24颗克隆进行菌落PCR检测，由图2结果表明所建文库的插入率为达91.7％。上述结果说明我们获得了库容和插入率均合格的TIM3纳米抗体噬菌体展示文库。
实施例3：TIM3纳米抗体的筛选及鉴定
抗体筛选：
(1)将溶解在100mM NaHCO3、pH>3作为对照)偶联在NUNC酶标板上，4℃放置过夜；
(2)第二天加入100μL 0.1％BSA，室温封闭2h；
(3)2h后，加入100μL噬菌体(2×1011CFU免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库)，室温作用1h；
(4)用0.05％PBS+Tween-20洗5遍，以洗掉非特异的噬菌体；
(5)用100mM三乙醇胺将与TIM3特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3轮，富集倍数分别为无富集，7.8倍和408倍(图3)。
用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆：
(1)从上述3轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选600个单个菌落并接种于含有100μg/mL的氨苄青霉素的TB培养基(1L TB培养基中含有2.3g KH2PO4，12.52g>2HPO4，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油)中，生长至对数期后，加终浓度1mM的IPTG，28℃培养过夜；
(2)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，室温静置1h；
(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司)，室温放置1h；
(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，室温放置1h；
(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪405nm波长处读取吸收值；
(6)当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时(Ratio+/-＞3)，判为阳性克隆孔。结果表明600颗克隆共出现86颗阳性克隆；
(7)将86颗阳性克隆孔的菌转摇在含有2mL氨苄青霉素浓度为100μg/mL的LB液体中以便提取质粒并进行测序；
(8)对比分析86株克隆系列，我们最终获得29株序列差异纳米抗体，分别编号为Nb1-Nb29(SEQ ID NO.:88-116)，其中具有16种明显差异CDR3区纳米抗体，其中Nb1-Nb5(SEQ ID NO.:88-92)为家族1；Nb6-Nb10(SEQ ID NO.:93-97)为家族2，Nb11-Nb13(SEQ IDNO.:98-100)为家族3，Nb14，Nb15(SEQ ID NO.:101，102)为家族4，Nb16-Nb29(SEQ ID NO.:103-116)为家族5-家族16。
实施例4：纳米抗体在宿主大肠杆菌的表达纯化
(1)将测序分析所获得的29株TIM3特异性克隆接种至5mL LA培养集中进行扩大培养；
(2)提取相应的质粒，并取1uL质粒，20uL电转感受态WK6，电转；
(3)将电转后细胞铺板于含有氨苄青霉素和葡萄糖的平板上，37℃过夜培养；
(4)挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床
培养过夜；；
(5)3)接种1mL的过夜菌种至330mL TB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6-1时，加入IPTG，28℃摇床培养过夜；
(6)离心收集菌体，并将菌体高渗裂解以获得抗体粗提液，然后利用镍离子亲和层析柱纯化抗体蛋白，TIM3纳米抗体原核表达纯化结果如图4所示。
实施例5：TIM-3纳米抗体检测特异性分析
5.1TIM-3稳转细胞株的构建
(1)将TIM-3基因序列扩增后插入pLVX-EF1α-puro载体，构建pLVX-EF1α-puro-TIM-3慢病毒质粒。
(2)TIM-3稳转细胞株的建立方法如下：将HEK 293T细胞传代于含5mL DMEM完全培养基的10cm直径培养皿中，将250uL Opti-MEM培养基(Invitrogen公司)与3ug包装质粒(pLP1：pLP2：VSVG＝1:1:1)、1ug慢病毒质粒混匀，然后加入20uL Polyfect转染试剂(QIAGEN公司)，充分混匀，室温放置10min，加入到含HEK293T细胞的培养皿中，37℃，5％CO2培养箱中培养2天。收集上清至50mL离心管中，培养皿中换10mL新鲜DMEM培养基继续培养1天。收集上清至前一日50mL离心管中，4000rpm，离心5min，将上清用0.45um的滤器过滤至新的离心管中。加入5×慢病毒浓缩液，充分混匀，置于4℃过夜。第二天4000g，4℃离心25min，去上清，以1mL DMEM培养基重悬慢病毒。将收获的TIM-3慢病毒颗粒与9mL DMEM培养基混匀，加入至新传代的HEK 293T细胞中。每隔两天重新消化细胞，用2.0ug/mL的puromycin进行筛选。筛选3-4轮后，利用流式细胞技术检测稳转细胞株是否构建成功。
5.2流式细胞技术检测TIM-3稳转细胞株
(1)根据处于临床Ⅰ期研究阶段的TIM-3抗体(TSR-022，专利号：US20150218274A1)序列，将其重链和轻链合成出来，分别构建入pFUSE-hIgG1e4-Fc1载体。(2)进一步利用HEK293F真核表达体系以及protein A蛋白纯化系统获得TIM-3阳性抗体(bench marker，BMK)，以用于TIM-3稳转细胞株的鉴定。
(2)在流式细胞检测中，将1.5×106个HEK>5细胞加入6ug抗体(实验组加入TIM-3阳性抗体BMK或者同型对照抗体AF70-Fc，空白组不加抗体)，混匀后4℃孵育20min。500uL>
5.3筛选具有高特异性、高亲和力的TIM-3纳米抗体
(1)将1.65×107个HEK293T>
(2)每孔加入6ug抗体(实验组为29株TIM-3纳米抗体，同型对照为PD-1、PD-L1或CTLA-4纳米抗体，空白组不加抗体)，混匀后4℃孵育20min。
(3)PBS洗一遍后，用100uL含二抗mouse-anti-His(Alexa Fluor 488)的抗体稀释液重悬，混匀后4℃孵育20min。
(4)PBS洗一遍后用200uL PBS重悬，利用流式细胞仪检测纳米抗体与稳转细胞表面TIM-3结合的阳性细胞的比例。实验结果见图6。以HEK293T作为阴性细胞对照，研究结果显示29种TIM-3纳米抗体与HEK293T均无结合(图中未显示)，有12种与TIM-3稳转细胞株有结合，其中10种TIM-3纳米抗体与稳转株表面的TIM-3结合力超过80％，而同型阴性对照抗体(PD-1、PD-L1和CTLA-4纳米抗体)与稳转株表面的TIM-3无结合，实验表明淘选获得的29种纳米抗体中有10种对TIM-3抗原显示了极高的特异性和亲和力，其纳米抗体编号依次为Nb16，Nb18，Nb20，Nb21SEQ ID NO.:108，Nb22SEQ ID NO.:109，Nb23，Nb24，Nb25，Nb26，Nb27.对应于序列依次为SEQ ID NO.:103，SEQ ID NO.:105，SEQ ID NO.:107，SEQ ID NO.:110，SEQ ID NO.:111，SEQ ID NO.:112，SEQ ID NO.:113，SEQ ID NO.:114)，其余序列的结合亲和力较高。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海洛启生物医药技术有限公司
<120> 针对T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3的单域抗体
<130> P2018-0335
<160> 145
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<211> 7
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 88
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 89
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202530
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val
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505560
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65707580
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<400> 90
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202530
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505560
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 91
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
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202530
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 92
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly
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202530
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Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 93
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 94
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 95
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
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202530
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115
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 96
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly
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115
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 97
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Arg Ala
202530
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val
354045
Ser Gly Ile Arg Asp Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
505560
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65707580
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
859095
Ala Asp Ile Thr Cys Arg His Ala Arg Pro Pro Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 98
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 98
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Arg Ala
202530
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val
354045
Ser Gly Ile Arg Asp Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
505560
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65707580
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
859095
Ala Asp Ile Thr Cys Arg His Ala Arg Pro Pro Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 99
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Arg Ala
202530
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val
354045
Ser Gly Ile Arg His Asp Gly Ser Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
505560
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65707580
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly
859095
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100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 100
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly
1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Arg Ala
202530
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val
354045
Ser Gly Val Arg His Asp Gly Ser Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
505560
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65707580
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100 105 110
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<211> 115
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 101
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 1015
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Val Trp Ile Phe Ser Asn Cys
202530
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Arg Lys Glu Arg Glu Phe Val
354045
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505560
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65707580
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100 105 110
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
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202530
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
354045
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505560
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100 105 110
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<211> 119
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 103
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
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202530
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Thr Leu Tyr Ile Ala Ser
202530
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354045
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505560
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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202530
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202530
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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202530
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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202530
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 111
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202530
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 112
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202530
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 113
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202530
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 114
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202530
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 115
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202530
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 116
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202530
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
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<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 117
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 119
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 121
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<210> 122
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 122
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 123
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<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 124
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<210> 125
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 125
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ttggagggtc tctgagactc 60
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<210> 126
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 126
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggata cacctacagc cgcgcctgca tgggttggtt ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtg ggtctcaggt attagagatg gtggtagcac cgcctatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc cgggacaacg ccaagaacac tctgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcggc cgacataact 300
tgtcgtcatg cccgaccgcc ctactggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctca 357
<210> 127
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 127
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtacag cctctggata cacctacagc cgcgcctgca tgggttggtt ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtg ggtctcaggt attagagatg atggtagcac cgcctatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc cgggacaacg ccaagaacac tctgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcggc cgacataact 300
tgtcgtcatg cccgaccgcc ctactggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctca 357
<210> 128
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 128
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtacag cctctggata cacctacagc cgcgcctgca tgggttggtt ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtg ggtctcaggt attagacatg atggtagcat cacctatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc cgggacaacg ccaagaacac tctgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgtggggc agacatagat 300
tgtcgtggta cccgaccgcc ctactggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctca 357
<210> 129
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 129
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ttggagggtc tctgagactc 60
tcctgtacag cctctggata cacctacagc cgcgcctgca tgggttggtt ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtg ggtctcaggt gttagacatg atggtagcat cacctatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc cgggacaacg ccaagaacac tctgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgtggggc agacatagat 300
tgtcgtggta cccgaccgcc ctactggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctca 357
<210> 130
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 130
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcaga ctggagggtc tctgaaactc 60
tcctgtacag cctctgtctg gatcttcagt aactgcgcga tggcctggta ccgccaggct 120
ccaaggaagg agcgcgagtt cgtctcagct attggctctt ttcgtgacac aaactacgcc 180
gactccgtga agggccgatt caccatttcc cgagacaacg ccaagaacac ggggtatcta 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggactcg gccatgtatt attgtaaaat ccaatgcgga 300
acgcaagtaa actggggcca ggggacccag gtcaccgtct cctca 345
<210> 131
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 131
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgaaactc 60
tcctgtacag cctctgtctg gatcttcagt aactgcgcga tggcctggta ccgccaggct 120
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gactccgtga agggccgatt caccatttcc cgagacaacg ccaagaacac ggggtatcta 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggactcg gccatgtatt attgtaaaat ccaatgcgga 300
acgcaagtaa actggggcca ggggacccag gtcaccgtct cctca 345
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<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 132
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcgtgtacag cctctagatc cacatattgc atgggctggt tccgccaggc tccagggaag 120
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ggcaccggta tagatatgcc atattggggc aaaggaaccc aggtcaccgt ctcctca 357
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 133
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctacaac tctctacatc gcctcattgg gctggttccg ccaggctcca 120
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gttccggcag gacggagact acaaccagat gcatataact actggggcca ggggacccag 360
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 134
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcttgtgcag cctctggatt cacattcagt gtggccgata tgagctgggt ccgccagggt 120
ccagggaagg ggttcgagtg ggtctcatct attaatagtg atggtgttag tacatactat 180
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ctgcgagcga acagcctgaa aactgaggac actgccgtgt attactgcgc cataggacat 300
acgccttgta ctgctggtag ctgtcgccga ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 135
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 135
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctccacata caccgtggtt cgcaattgtt tcggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaaga agcgcgaggg ggtcgcagtt attgacaggg atggtagtac aaggtacgca 180
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caaatgagca gcctggaacc cgaggacact gccgtttact actgtgcggc tgattggaat 300
aacgatcgta gctgtcctct atgggccgac ggctttggtt actggggcca ggggacccag 360
gtcaccgtct cctca 375
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 136
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacattcagt gtagccgaca tgacctgggt ccgccagggt 120
ctagggaagg ggttcgagtg ggtagcatcc gttaatagtg atggtggttc cacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 137
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
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gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaaggacag tctgtatcta 240
caaatgaata gcctgaaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcggc agattggggc 300
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accgtctcct ca 372
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 138
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcggg ctggagggtc tctgagactc 60
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<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 139
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 140
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 141
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<212> DNA
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<400> 142
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 144
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gtctcctca 369
<210> 145
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 145
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ttggagggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaac cacctctcgc aactactgta tgggttggtt tcgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgaatg ggtcgcacat attgataaat atggtacatc tgactacact 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc aaagacaacg ccaagaacac gctatatcta 240
caaatgaaca gcctgaaacc cgaggacact gccatgtact actgcgcgat ctcgtcccaa 300
tatgggttgt gtctagccca aaccggcgac tatgcctact taggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
机译： 针对三个免疫球蛋白结构域和粘蛋白t淋巴细胞（tim3）的抗体和使用方法
机译： 免疫球蛋白单可变域抗体，针对rsv融合f蛋白
机译： RSV融合前针对F蛋白的免疫球蛋白单可变域抗体
