强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽及其合成方法和应用

摘要

强啡肽A(1‑8)与神经降压素(8‑13)相偶联的环化杂合肽及其合成方法和应用，涉及一种环化杂合肽及其合成方法和应用。是要解决现有阿片类药物的生物稳定性较差，抗神经性疼痛效果不佳的问题。该杂合肽的氨基酸序列为Dmt‑Gly‑c(Cys‑NMePhe‑Leu‑Arg‑Arg‑Ile‑Cys)‑Gly‑NMeArg‑Lys‑Pro‑Trp‑Tle‑Leu。方法：一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理；二、脱除“Fmoc”保护基团；三、氨基酸缩合反应；四、肽链的延长；五、二硫键的形成；六、肽链从树脂上的切割；七、粗肽的脱盐与纯化。本发明通过多位点非天然氨基酸替换以及环化修饰也能够增强杂合肽的生物稳定性，并具有抗神经性疼痛的作用。本发明的杂合肽用于制备抗神经性疼痛药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种环化杂合肽及其合成方法和应用。

背景技术

众所周知，阿片及其提取物一直用于镇痛治疗。从阿片中分离出的吗啡就是现在临床应用最广泛的镇痛药物之一。然而吗啡等药物在安全临床使用的缺陷也很多，如抑制呼吸、引起血压降低和心搏徐缓、便秘、易引起精神依赖、成瘾和镇痛耐受等。此外，吗啡对慢性疼痛如神经病理性疼痛的治疗效果不佳。研究表明，阿片肽在痛觉信息的传递和调制过程中起着重要作用。继脑啡肽与内啡肽发现以后，1979年，研究人员又从猪的垂体中发现了一种具有阿片活性的内源性十七肽，并命名为强啡肽。强啡肽(dynorphin)对κ-阿片受体具有极高的亲和性和选择性，是κ-受体的内源性配体，其与脑啡肽、内啡肽和内吗啡肽同属于内源性阿片肽家族。强啡肽原是强啡肽的前体，在体内最终转化为强啡肽A(dynorphin A,Dyn A)和强啡肽B(dynorphin B,Dyn B)。内源性的强啡肽A有多种片断结构，其中强啡肽A(1-8)是强啡肽最小活性片段。关于强啡肽在疼痛领域的研究较多，强啡肽作为一种镇痛介质被广泛用于评价镇痛效果。然而强啡肽的镇痛活性相对较弱，明显低于μ-阿片受体激动剂如吗啡等介导的镇痛效果。此外，强啡肽的生物稳定性较差，镇痛持续时间较短，血脑屏障通透率较低，从而限制了其作为临床镇痛药物的发展。

早在1973年美国学者从牛的下丘脑中发现了由十三个氨基酸组成的活性神经肽，即神经降压素(neurotensin，NT)。在中枢神经系统内，神经降压素作为神经递质或调质而发挥作用,其效应包括降温、镇痛、调节多巴胺能传递和刺激垂体前叶激素释放。神经降压素在抑制痛觉传递过程中与阿片肽有着重要的关系。神经降压素神经末梢及神经降压素受体在中枢神经系统内广泛分布于与镇痛有关的区域，而且与内源性阿片肽神经末梢及阿片受体分布相伴行。有研究表明，中枢注射神经降压素产生的镇痛效应与激活阿片系统，引起内源性阿片肽的释放有关。此外，已经证实神经降压素的第8-13位氨基酸“Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu”是神经降压素的活性最小片段，其氨基酸序列中有两个带正电的精氨酸。精氨酸的胍基基团能够与细胞表面的阴离子基团形成二价的氢键，增强多肽对生物膜的通透性，如血脑屏障。将神经降压素(8-13)通过位点修饰得到的类似物序列NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu具有显著的外周给药的镇痛活性。

发明内容

本发明是要解决现有阿片类药物的生物稳定性较差，抗神经性疼痛效果不佳的问题，提供强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽及其合成方法和应用。

本发明强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的氨基酸序列如下：

Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Arg-Arg-Ile-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu。

其中序列“Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Arg-Arg-Ile-Cys)”为多位点修饰的环化的强啡肽A(1-8)的残基序列，“Gly”为杂合肽的中间连接子，“NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu”为多位点修饰的神经降压素(8-13)的残基序列。(Dmt代表2,6-二甲基Tyr，NMePhe代表N-甲基Phe，NMeArg代表N-甲基Arg，Tle代表tert-Leu)

上述强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的合成方法，包括以下步骤：

一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂放入合成仪，加二氯甲烷搅拌30～40min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤溶剂；其中带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂的质量与二氯甲烷的体积比为1g：(7～12)mL；

二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3～5min，抽干，重复3～5次，然后在树脂中加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5～10min后抽干，重复2～3次，再加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15～20min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用DMF洗涤除净脱保护溶液，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；其中树脂的质量与第一次加入的脱保护溶液的体积比为1g：(8～12)mL；树脂的质量与第二次加入的脱保护溶液的体积比为1g：(10～14)mL；

三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀得混合溶液，然后将混合溶液加入到步骤二脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60～72min；

通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；

四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照杂合肽氨基酸序列的顺序，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；其中杂合肽的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Arg-Arg-Ile-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；

五、二硫键的形成：称取I₂溶于无水甲醇和DMF混合液中，配成I₂溶液，并将I₂溶液加入到肽树脂中，通入氩气保护，避光搅拌反应3～5小时成环，抽干反应液；其中混合溶液中无水甲醇和DMF的体积比为4：1，I₂的质量与混合溶液的体积比为2.6g：100mL，I₂溶液与肽树脂的体积比为100mL：1g；

六、肽链从树脂上的切割：将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除，然后用二氯甲烷和甲醇交替洗涤肽树脂，充分抽干溶剂后，向肽树脂中加入切割试剂，于室温下切割反应3～5h；

收集切割试剂并减压旋干，用冰冷乙醚析出沉淀，静置后去除乙醚上清，再用水及乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色的固体粉末粗肽；

七、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度10％-20％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物，再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的固体粉末纯肽。

步骤三中“Fmoc”基团保护的氨基酸的摩尔量为Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。

步骤三中N-羟基苯并三氮唑的摩尔量为Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。

步骤三中O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。

步骤三中二异丙基乙胺的摩尔量为Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔量的5-6倍。

步骤六中每克肽树脂加入10-25mL的切割试剂。

步骤六中所述切割试剂由三氟乙酸、二异丙基硅烷和水按照体积比95：2.5：2.5混合而成。

步骤六中将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除的具体方法为：

将肽树脂用DMF洗涤3～5min，抽干，重复3～5次，然后在树脂中加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5～10min后抽干，重复2～3次，再加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15～20min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用DMF洗涤除净脱保护溶液，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂。

上述多位点修饰的强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽在制备多肽镇痛药物中的应用。

上述多位点修饰的强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽在制备抗神经性疼痛药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明多位点修饰的强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽，是将强啡肽A(1-8)的氨基酸序列“Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile”通过多位点修饰与Cys二硫键环化得到“Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Arg-Arg-Ile-Cys)”氨基酸残基序列，将神经降压素(8-13)的氨基酸序列“Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu”通过多位点修饰得到“NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu”氨基酸残基序列，利用中间连接子“Gly”将两部分氨基酸残基序列相偶联，构建一种新型高效的杂合肽。

其中多位点修饰是将强啡肽A(1-8)的氨基酸序列“Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile”的1位Tyr用Dmt替代，3位Gly用Cys替代，4位Phe用NMePhe替代，以及9位增加Cys。将神经降压素(8-13)的氨基酸序列“Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu”的1位Arg用NMeArg替代，2位Arg用Lys替代，4位Tyr用Trp替代，5位Ile用Tle替代。

然后进行环化，具体是将3位和6位Cys二硫键环化得到“Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Arg-Arg-Ile-Cys)”氨基酸残基序列。

通过多位点非天然氨基酸替换能够增强多肽的抗酶解能力，而且环化修饰也能提高多肽药物的生物稳定性，各种水解酶类不易分解环化多肽的肽键，进一步增强多肽的抗酶解能力，进而增强药物向中枢系统的运输能力，提高药物的利用率和效能。

多肽只要通过位点非天然氨基酸修饰，那么各种水解酶类就不易识别非天然氨基酸，不易降解多肽，进而增强多肽的抗酶解能力。多位点修饰，多肽的抗酶解能力就更强。多位点修饰和环化协同作用，显著增强了多肽的酶解稳定性。实验表明，杂合肽的小鼠脑质膜半衰期达到396.2±28.0min，杂合肽的血清半衰期达到308.0±29.5min。

此外，将杂合肽的强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)的修饰序列中间加入一个小分子氨基酸连接子“Gly”，可以提高杂合肽的柔性构象，保留强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)两部分修饰序列的生物活性。神经降压素(8-13)是神经降压素的最小活性片段，杂合肽的神经降压素(8-13)部分能够通过激活阿片受体系统，引起内源性的阿片肽释放，参与镇痛作用的发挥，进而与杂合肽的强啡肽A(1-8)部分产生高效的协同镇痛作用。而且，该杂合肽具有多个带正电的氨基酸残基，能够增强杂合肽对血脑屏障的穿透能力，进而提高药物的中枢利用率。此外，杂合肽中的神经降压素(8-13)部分能够降低阿片类药物的镇痛耐受、胃肠道和心血管等不良副作用。

通过酶解稳定性实验，镇痛与急性耐受实验，抗神经病理性疼痛活性实验，及在体胃肠道和血压实验，对本发明合成的杂合肽进行药理学活性鉴定。结果表明，本发明的杂合肽具有较高的酶解稳定性。通过中枢给药，在热甩尾实验中具有明显的镇痛活性。而且，杂合肽具有外周给药的高效镇痛效果，及显著的抗神经性疼痛活性，其最大镇痛效果在侧脑室注射药物10min后产生，最大缩足反应阈值为1.134g，而且，其抗神经性疼痛作用持续时间较长，可持续至少40min以上。此外，杂合肽具有无耐受副作用的镇痛特性，且其对胃肠道和心血管系统的副作用也明显降低。

因此，本发明的杂合肽在制备高效、无镇痛耐受、低胃肠道和心血管副作用的多肽镇痛药物方面具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为侧脑室注射杂合肽DANT的镇痛效应-时间曲线；其中■表示杂合肽DANT、10nmol，●表示杂合肽、3nmol，▲表示杂合肽DANT、1nmol，▼表示杂合肽DANT、0.3nmol，◆表示生理盐水；

图2为皮下注射杂合肽DANT的外周镇痛效果；其中■表示杂合肽DANT(10μmol/kg，皮下)，●表示生理盐水(皮下)；

图3为侧脑室注射吗啡的镇痛耐受剂量曲线；其中■表示生理盐水+吗啡，●表示吗啡(10nmol)+吗啡；

图4为侧脑室注射杂合肽DANT的镇痛耐受剂量曲线；其中■表示生理盐水+杂合肽DANT，●表示杂合肽DANT(10nmol)+杂合肽DANT；

图5为侧脑室注射杂合肽DANT的抗神经性疼痛活性；其中■表示杂合肽DANT、10nmol，●表示杂合肽DANT、3nmol，▲表示杂合肽DANT、1nmol，▼表示生理盐水；

图6为侧脑室注射杂合肽DANT对胃肠道炭餐推进的作用；

图7为静脉注射吗啡和杂合肽DANT对大鼠系统动脉压的作用；

图8为静脉注射吗啡和杂合肽DANT对大鼠心率的作用。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的氨基酸序列如下：

Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Arg-Arg-Ile-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu。

本实施方式是将强啡肽A(1-8)的氨基酸序列“Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile”通过多位点修饰与Cys二硫键环化得到“Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Arg-Arg-Ile-Cys)”氨基酸残基序列，将神经降压素(8-13)的氨基酸序列“Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu”通过多位点修饰得到“NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu”氨基酸残基序列，利用中间连接子“Gly”将两部分氨基酸残基序列相偶联，构建一种高效的杂合肽。

通过多位点非天然氨基酸替换能够增强多肽的抗酶解能力，而且环化修饰也能提高多肽药物的生物稳定性，各种水解酶类不易分解环化多肽的肽键，进一步增强多肽的抗酶解能力，进而增强药物向中枢系统的运输能力，提高药物的利用率和效能。

具体实施方式二：本实施方式强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽的合成方法，包括以下步骤：

一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂放入合成仪，加二氯甲烷搅拌30～40min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤溶剂；其中带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂的质量与二氯甲烷的体积比为1g：(7～12)mL；

二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3～5min，抽干，重复3～5次，然后在树脂中加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5～10min后抽干，重复2～3次，再加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15～20min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用DMF洗涤除净脱保护溶液，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；其中树脂的质量与第一次加入的脱保护溶液的体积比为1g：(8～12)mL；树脂的质量与第二次加入的脱保护溶液的体积比为1g：(10～14)mL；

三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀得混合溶液，然后将混合溶液加入到步骤二脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60～72min；

通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；

四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照杂合肽氨基酸序列的顺序，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；其中杂合肽的氨基酸序列为：Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Arg-Arg-Ile-Cys)-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu；

五、二硫键的形成：称取I₂溶于无水甲醇和DMF混合液中，配成I₂溶液，并将I₂溶液加入到肽树脂中，通入氩气保护，避光搅拌反应3～5小时成环，抽干反应液；其中混合溶液中无水甲醇和DMF的体积比为4：1，I₂的质量与混合溶液的体积比为2.6g：100mL，I₂溶液与肽树脂的体积比为100mL：1g；

六、肽链从树脂上的切割：将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除，然后用二氯甲烷和甲醇交替洗涤肽树脂，充分抽干溶剂后，向肽树脂中加入切割试剂，于室温下切割反应3～5h；

收集切割试剂并减压旋干，用冰冷乙醚析出沉淀，静置后去除乙醚上清，再用水及乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色的固体粉末粗肽；

七、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度10％-20％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物，再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的固体粉末纯肽。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤三中N-羟基苯并三氮唑的摩尔量为Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：步骤三中“Fmoc”基团保护的氨基酸的摩尔量为Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。其它与具体实施方式二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：步骤三中O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的2.5-3倍。其它与具体实施方式二至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是：步骤三中二异丙基乙胺的摩尔量为Fmoc-Leu-Wang树脂摩尔量的5-6倍。其它与具体实施方式二至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是：步骤六中每克肽树脂加入10-25mL的切割试剂。其它与具体实施方式二至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式七不同的是：步骤六中所述切割试剂由三氟乙酸、二异丙基硅烷和水按照体积比95：2.5：2.5混合而成。其它与具体实施方式七相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二至八之一不同的是：步骤六中将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除的具体方法为：

将肽树脂用DMF洗涤3～5min，抽干，重复3～5次，然后在树脂中加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5～10min后抽干，重复2～3次，再加入体积百分浓度为20％～25％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15～20min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用DMF洗涤除净脱保护溶液，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂。其它与具体实施方式二至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式多位点修饰的强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽在制备多肽镇痛药物中的应用。

具体实施方式十一：本实施方式多位点修饰的强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽在制备抗神经性疼痛药物中的应用。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

本实施例多位点修饰的强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)相偶联的环化杂合肽DANT的合成方法，包括以下步骤：

一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将1g带有一个氨基酸残基的Fmoc-Leu-Wang树脂放入合成仪，加10mL二氯甲烷搅拌30min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤溶剂。

二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3min，抽干，重复3次。在树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次，再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂，最后用10mL DMF洗涤除净脱保护试剂，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂。

三、氨基酸缩合反应：依次将相当于Fmoc-Leu-Wang树脂2.5-3倍摩尔量的“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于10mL DMF中，再加入相当于Fmoc-Leu-Wang树脂5-6倍摩尔量的二异丙基乙胺后混匀得混合溶液，然后将混合溶液加入到所述脱除保护的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60min。通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体。

四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照杂合肽DANT氨基酸序列的顺序Dmt-Gly-Cys-NMePhe-Leu-Arg-Arg-Ile-Cys-Gly-NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂。

五、二硫键的形成：称取2.6g的I₂溶于80mL无水甲醇和20mL的DMF混合液中，配成0.1mol/L的I₂溶液，并将其加入到肽树脂中，通入氩气保护，避光搅拌反应3～5小时成环，抽干反应液。

六、肽链从树脂上的切割：按照步骤二的方法将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除。用二氯甲烷、甲醇交替洗涤树脂，充分抽干溶剂后，按每克肽树脂加入18mL的切割试剂，切割试剂由三氟乙酸、二异丙基硅烷、水以95：2.5：2.5的体积比混合而成，于室温下切割反应3h。收集切割试剂并减压旋干，用冰冷乙醚析出沉淀，静置片刻后去除乙醚上清，再用水及少量乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色的固体粉末粗肽。

七、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度16％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物。再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色的固体终产物杂合肽DANT，终产率为27％，质谱和色谱分析检测结果如表1所示。

表1.杂合肽DANT的质谱和色谱分析检测结果

表1的结果表明，本发明得到的杂合肽DANT的检测值与理论值相符。

本实施例制备的多位点修饰的强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)相偶联的新型环化杂合肽的生物活性实验如下：

1、酶解稳定性实验

通过离体方法制备100％小鼠血清和15％脑质膜样品，取10μL多肽母液(10^-2M)，加入到190μL的100％小鼠血清或15％脑质膜中，立即振荡混匀，然后迅速取出20μL混合液，加入离心管中计时为0min，余者于37℃下继续孵育，并分别在5min，10min，15min，30min，60min，120min，240min取出20μL。酶解过程的终止：于取出的样品中加入90μL乙腈振荡混匀，样品置于冰上放置5min，再用90μL0.5％的冰冷乙酸稀释以确保酶解过程停止。13,000g离心15min，收集上清，-80℃冻存，直至RP-HPLC分析。

实验结果见表2。表2的结果显示，强啡肽A(1-8)的小鼠脑质膜和血清半衰期比神经降压素(8-13)略高，然而强啡肽A(1-8)和神经降压素(8-13)的小鼠脑质膜和血清半衰期均较短，不超过20min。但是，杂合肽DANT的脑质膜和血清半衰期都显著长于强啡肽A(1-8)和神经降压素(8-13)，高约二十到三十倍左右。该结果表明通过多位点非天然氨基酸修饰以及多肽环化，能够显著提高杂合肽DANT的酶解稳定性。

表2.强啡肽A(1-8)，神经降压素(8-13)及杂合肽DANT的脑质膜和血清半衰期

2、热甩尾镇痛实验

实验采用昆明系雄性小鼠，18-22g，环境温度：20℃，水浴温度：50±0.5℃。给药前先测定小鼠的基础痛阈(control latency，CL)，将小鼠鼠尾的1/3-1/2浸入水浴，记录鼠尾从刚浸入水浴至发生收缩的时间。过于敏感(<3s)或迟钝的(>5s)小鼠弃去不用，截止时间10s，以防止小鼠烫伤。侧脑室给药后第5,10,15,20,25,30,40and 50min各测一次甩尾潜伏期(test latency，TL)，皮下给药后第5,10,15,20,25,30,45,60and 90min各测一次TL，0.9％生理盐水作为空白对照。结果以最大可能效应百分比(maximum possible effect，％MPE)表示：％MPE＝100×(TL-CL)/(10-CL)。

中枢给药的小鼠热甩尾镇痛实验结果如图1所示，侧脑室注射0.3-10nmol不同剂量的杂合肽DANT，其表现浓度依赖型的显著的镇痛活性。最大镇痛效果在侧脑室注射药物10min后产生，最大镇痛％MPE值为90.11％。在注射药物15min后，镇痛％MPE值仍能达到87.07％，表明杂合肽DANT产生较高镇痛活性的持续时间较长。在50min检测，杂合肽DANT的镇痛％MPE值24.13％，即镇痛持续时间至少50min以上，这表明杂合肽DANT具有高效的中枢镇痛活性。此外，外周给药的镇痛实验结果如图2所示，通过皮下注射10μmol/kg固定剂量的杂合肽DANT，结果发现DANT仍然具有高效持续的镇痛活性。最大镇痛效果在注射药物15min后产生，其镇痛％MPE值为84.24％。在给药后90min测定DANT的镇痛％MPE值仍能达到27.03％，表明外周注射杂合肽DANT的镇痛持续时间可达到90min以上，即外周注射杂合肽DANT的镇痛持续时间较长。上述结果表明多位点修饰的强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)相偶联的新型环化杂合肽显著增强了药物的镇痛活性和持续时间，即杂合肽具备了高效镇痛活性的特点。

3、急性耐受实验

实验选取昆明系雄性小鼠，18-22g，环境温度：20℃。利用PE-10插管对小鼠侧脑室埋管，手术后3天给药。根据杂合肽的镇痛活性，确定药物剂量，测定急性镇痛耐受。小鼠提前1小时侧脑室注射药物或生理盐水1次，之后分别注射不同剂量的药物，测定疼痛阈值变化，进而对杂合肽进行镇痛耐受评估，通过吗啡作为阳性对照。

中枢注射吗啡和杂合肽DANT的镇痛耐受结果如图3和4所示，提前1小时对小鼠侧脑室注射生理盐水，之后侧脑室注射0.3-10nmol不同剂量的吗啡和杂合肽DANT均产生显著的镇痛效果，且呈浓度依赖型特点，表明对小鼠提前注射生理盐水并不影响吗啡和杂合肽DANT等镇痛药物活性的发挥。然而，通过提前1小时侧脑室注射10nmol剂量的吗啡，之后再注射0.3-10nmol不同剂量的相对应药物吗啡，其药物镇痛剂量曲线明显右移，中枢镇痛活性显著降低，即吗啡产生了明显的药物镇痛耐受。但是，提前1小时侧脑室注射10nmol剂量的杂合肽DANT，再注射0.3-10nmol不同剂量的杂合肽3，其镇痛剂量曲线与提前注射生理盐水的镇痛剂量曲线几乎重合，并没有产生明显的左移或者右移。该结果表明提前注射杂合肽DANT对第二次急性注射DANT的镇痛活性几乎没有影响，表明DANT具有无耐受副作用的镇痛特性。该结果表明，杂合肽DANT具有无药物耐受副作用的高效镇痛特性。

4、抗神经性疼痛实验

通过小鼠坐骨神经分支选择损伤的方法稳定建立神经病理性疼痛动物模型。实验选取昆明系雄性小鼠，20-25g，紧扎并切断小鼠一侧的坐骨神经末端三分支的其中两支，即胫神经和腓总神经分支，保留腓肠神经分支。术后24小时开始出现持续性的疼痛，持续时间达7周以上，即诱导了稳定的神经性疼痛动物模型。通过Von Frey纤维测定机械痛阈，研究中枢注射药物的抗神经性疼痛活性。

中枢注射杂合肽DANT的抗神经性疼痛作用结果如图5所示，侧脑室注射1-10nmol不同剂量的DANT，能够剂量依赖的引起缩足反应阈值升高，证明杂合肽DANT对神经性疼痛具有显著的镇痛活性。其最大镇痛效果在侧脑室注射药物10min后产生，最大缩足反应阈值为1.134g。而且，DANT的抗神经性疼痛作用持续时间较长，可持续至少40min以上，表明杂合肽DANT对神经病理学疼痛具有高效的镇痛活性。

5、胃肠道炭餐推进实验

实验采用雄性昆明系小鼠，体重25-30g，禁食20h以后开始实验，侧脑室注射不同浓度药物，注射体积5μL。之后给小鼠口服0.2mL的炭餐(5％阿拉伯胶，10％活性炭水溶液)。30min以后处死小鼠，将小肠剥离。测量小肠的全长(幽门结至盲肠末端)，以及炭餐在小肠中推进的距离。药物的胃肠道转运活性以炭餐在小肠中推进的距离与整个小肠长度的比值百分比表示。

胃肠道炭餐推进实验实验结果如图6所示(图6中表示吗啡，表示杂合肽DANT)，侧脑室给药后，炭餐在胃肠道转运活性越低，则药物对小鼠胃肠道炭餐推进的抑制作用越强。通过侧脑室注射0.5-5nmol不同剂量的吗啡和杂合肽DANT，均产生浓度依赖型的抑制胃肠道炭餐推进作用，而且药物浓度越高，抑制作用越强。但是，所有浓度下阿片生物碱吗啡对胃肠道炭餐推进的抑制效果显著高于对应浓度下的杂合肽DANT，这表明中枢注射杂合肽DANT降低了胃肠道碳餐推进作用效果，即具有较低的胃肠道系统副作用的优点。

6、在体大鼠血压实验

实验采用Wistar大鼠，200-300g，用20％的氨基甲酸乙酯麻醉(l.2g/kg,i.p.)，为了保持麻醉状态良好，可能需要临时补加麻醉药物。切开大鼠的气管，清除管内粘液，动物能自主呼吸。PE-50导管插入到颈外静脉以备静脉给药，PE-50导管插入颈大动脉，并与YP-100压力传感器相连，记录给药后血压的变化。系统动脉压和心率数据主要通过成都泰盟BL-420F生物记录系统平均化处理获得。药物静脉每次注射100μL，10～15秒内注射完成。

吗啡和杂合肽DANT对大鼠心血管作用的实验结果如图7和8所示(图7和8中表示吗啡，表示杂合肽DANT)，静脉注射1-10nmol不同剂量的吗啡和杂合肽DANT均能够显著降低大鼠系统动脉血压，并且呈剂量依赖型特点。然而所有浓度下杂合肽DANT降低动脉血压的效果明显低于对应浓度下的吗啡。此外，静脉注射1-10nmol剂量的吗啡和杂合肽DANT剂量依赖的降低大鼠的心率。与系统动脉压类似，所有浓度下杂合肽DANT降低动脉血压的效果明显低于对应浓度下的吗啡。该结果表明，杂合肽DANT对在体心血管系统的作用效果明显低于吗啡，即具有较低的心血管副作用的优点。

综上所述，本发明多位点修饰的强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)相偶联的新型环化杂合肽，是将强啡肽A(1-8)的氨基酸序列“Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile”通过多位点修饰与二硫键环化得到“Dmt-Gly-c(Cys-NMePhe-Leu-Arg-Arg-Ile-Cys)”氨基酸残基序列，将神经降压素(8-13)的氨基酸序列“Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu”通过多位点修饰得到“NMeArg-Lys-Pro-Trp-Tle-Leu”氨基酸残基序列，利用中间连接子“Gly”将两部分氨基酸残基序列相偶联，构建一种新型高效的杂合肽。通过多位点非天然氨基酸替换以及环化修饰能够显著增强杂合肽的生物稳定性。将杂合肽的强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)的修饰序列中间加入一个小分子氨基酸连接子“Gly”，可以提高杂合肽的柔性构象，保留了强啡肽A(1-8)与神经降压素(8-13)两部分序列的生物活性，解决现有阿片类药物的生物稳定性较差，镇痛活性较低和持续时间较短，抗神经性疼痛效果不佳，及具有镇痛耐受、胃肠道和心血管系统副作用的问题。

通过酶解稳定性实验，镇痛与急性耐受实验，抗神经病理性疼痛活性实验，及在体胃肠道和血压实验，对本发明合成的杂合肽进行药理学活性鉴定。结果表明，本发明的杂合肽具有较高的酶解稳定性。通过中枢给药，在热甩尾实验中具有明显的镇痛活性。而且，杂合肽具有外周给药的高效镇痛效果，及显著的抗神经性疼痛活性。此外，杂合肽具有无耐受副作用的镇痛特性，且其对胃肠道和心血管系统的副作用也明显降低。因此，本发明的杂合肽在制备高效、无镇痛耐受、低胃肠道和心血管副作用的多肽镇痛药物方面具有潜在的应用价值。