一种适用于心血管病患者的抗呼吸道合胞病毒药物

摘要

本发明属于医药技术领域，涉及一种适用心血管病患者的抗病毒感染药物的应用。阿魏酸衍生物对呼吸道合胞病毒（RSV）有选择抑制作用，对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）有增殖和保护作用，用于制备具有心血管病症状的患者可使用的抗病毒药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种阿魏酸衍生物在制备抗病毒的药物中的应用，尤其是在制备抗呼吸道合胞病毒的药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

住院患者引起呼吸道感染的常见病原菌有呼吸道合胞病毒等，尤其是先天性心脏病患儿抵抗力差，是呼吸道合胞病毒的易感人群，但在儿科给药处方中，利巴韦林滥用比较严重（李青等，中华医院感染学杂志，2015,25(18):4260）。利巴韦林体外具抑制呼吸道合胞病毒（RSV）、流感病毒等多种病毒的作用，在体内对呼吸道合胞病毒也具免疫作用，但服用利巴韦林可引起心肌损害，因此具有心脏病史或明显心脏病症状的患者不能使用利巴韦林（Ivey KS et al. J Am Coll Cardiol, 2018, 71(14):1574；杨聪德等，临床军医杂志，2016,44(10):1099）。阿魏酸（Ferulic acid，FA）具有抗氧化、抗炎、降血栓、治疗心脏病、抗菌和抗病毒作用，尤其是对RSV诱导的炎症蛋白-2具有抑制作用（欧仕益等，中药材，2001,24（3）：220）。本发明以阿魏酸为先导化合物设计新结构，解决现有药物在心血管风险方面的缺陷，筛选抗病毒的新型阿魏酸衍生物。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种阿魏酸衍生物在制备抗病毒感染药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种含有所述阿魏酸衍生物的药物组合物。

本发明的又一目的在于提供一种所述药物组合物，在制备治疗和预防病毒感染相关的药物中的应用，尤其是在制备治疗和预防呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)或肠道病毒71型(EV71)感染的药物中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种所述药物组合物，在治疗和预防病毒感染相关的病症中的应用，尤其是先天性心脏病、心脏病史或明显心血管病症状的患者在治疗和预防病毒感染相关的病症中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种所述药物组合物为口服剂或注射剂，优选剂型为片剂、胶囊剂、滴丸、分散片、颗粒剂、水针或粉针，更优选的是片剂、胶囊剂。

实现本发明所述的阿魏酸衍生物，其特征在于，所述的阿魏酸衍生物的结构式如通式（Ⅰ）所示：

（Ⅰ）。

其中，所述R1选自氢、烷基或乙酰基；R2选自氢或烷基；R3选自氢或甲磺酰基。术语“烷基”包括 1-10 个碳原子的直链或支链基团。更优选的烷基基团是 1-6 个碳原子的低级烷基基团。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、异己基、庚基、辛基等。

上述阿魏酸衍生物进一步优选的结构式如通式（Ⅰ）所示。其中，所述R₁选自氢、甲基、乙基或乙酰基；R₂选自氢、甲基或乙基；R₃选自氢或甲磺酰基。

上述阿魏酸衍生物最优选如下列化合物之一：(E)-2-(4-甲磺酰基苯基)-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)丙烯酸、(E)-2-(4-甲磺酰基苯基)-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)丙烯酸乙酯、 (E)-2-(4-甲磺酰基苯基)-3-(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)丙烯酸乙酯、(E)-2-苯基-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)丙烯酸。

上述阿魏酸衍生物精选结构式为：

。

本发明的目的是提供阿魏酸衍生物如式（Ⅰ）在制备治疗和预防呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)或肠道病毒71型(EV71)感染药物中的应用，在治疗和预防呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)或肠道病毒71型(EV71)感染相关的病症中的应用，尤其是先天性心脏病、有心脏病史或明显心血管病症状的患者在治疗和预防病毒感染相关的病症中的应用。

本发明以阿魏酸为先导化合物设计新结构，筛选抗病毒的新型阿魏酸衍生物，阿魏酸衍生物的结构设计如下所示：

。

本发明的阿魏酸衍生物通过Perkin缩合反应，将取代苯乙酸和取代苯甲醛脱水得到乙烯桥连有两个苯环的新型阿魏酸衍生物。将取代苯乙酸、取代苯甲醛、乙酸酐和三乙胺混合后，在130～140℃的电热包中回流反应约4小时，加入少量的水分解，将反应物冷却到室温，放置析出固体。再进一步酯化、酰化或成盐得到目标结构。阿魏酸衍生物的反应路线如下所示：

。

本发明的咖啡酸衍生物进行抗呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)或肠道病毒71型(EV71)，抗氧化，血管内皮细胞增殖的筛选实验。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明中合成出的新型阿魏酸衍生物，其中衍生物A3与阿魏酸（FA）比较，对呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制作用显著增强，也强于临床常用利巴韦林；衍生物A3代谢后产生A2具有抗氧化作用，降低心血管系统的氧化损伤；衍生物A3对内皮细胞具有增殖作用，表现出较低的心血管风险，在治疗RSV病毒感染性疾病领域存在潜在的应用价值。

(2)本发明合成出的化合物结构明确、抑制效果明确，实用性强，易于生产推广。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。以下实施例中各剂型的辅料可以用药学上可接受的辅料替换，或者减少、增加。其中，10%PVPK30乙醇液，“适量”含义：以片剂为例，用量一般为2％～5％，浓度一般为0.5％～5％。

附图说明

图-1是阿魏酸衍生物对HUVEC增殖和凋亡的影响图。

具体实施方式

实施例 1 衍生物制备

在单口瓶中，将取代苯乙酸(0.01mol)，取代苯甲醛(0.01mol)，乙酸酐6.0mL（新蒸馏）和三乙胺0.7mL（新蒸馏）混合后，在130～140℃的电热包中回流反应4～6小时，降温到100℃，加入蒸馏水1～2mL分解，再搅拌反应5分钟，将反应物移出电热包，冷却到室温，投入到60mL的水中，室温放置析出固体，过滤得到固状产物。

上步的固状产物，若加入NaOH溶液，调节pH在12左右，在90℃下搅拌反应2小时，冷却至室温，用稀HCl溶液调节pH在6～7，析出类白色固体，过滤得到产物，可制备得到具有酚羟基的E-构型衍生物A1、A4、A5和A6。将制备出的衍生物A1，加入无水乙醇中，再加入浓硫酸，回流反应6小时，析出酯化后的E-构型衍生物A2。将A2加入乙酸酐，加热回流3小时，用旋转蒸发仪除去乙酸酐，用乙酸重结晶，可得到酰化和酯化后的E-构型衍生物A3。

衍生物（A1）：(E)-2-(4-甲磺酰基苯基)-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)丙烯酸

将4-甲磺酰基苯乙酸和3-甲氧基-4-羟基苯甲醛混合，按照上述条件反应，最终得到白色固体，收率62%，熔点235.2～235.3℃；HPLC（甲醇：水＝5:5，0.06%乙酸）：保留时间6.734，含量98.86%；紫外最大吸收（溶剂为甲醇），λmax＝326；¹H>J>J=>J>J>J>13C>

衍生物（A2）：(E)-2-(4-甲磺酰基苯基)-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)丙烯酸乙酯

将上一步衍生物（A1）加入无水乙醇中，再加入浓硫酸回流，按照上述条件处理，得到白色固体，收率74％，熔点133.3-133.6℃；HPLC（甲醇：水＝5:5，0.06%乙酸）：保留时间12.052，含量97.0%；紫外最大吸收（溶剂为甲醇），λmax＝330；¹H>J>J>J>J>J>J>J>13C>

衍生物（A3）：(E)-2-(4-甲磺酰基苯基)-3-(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯基)丙烯酸乙酯

将上一步衍生物（A2）加入乙酸酐中加热回流，按照上述条件处理，得到白色固体，收率78％，熔点133.3-133.6℃；HPLC（甲醇：水＝6:4）：保留时间11.282，含量96.9%；紫外最大吸收（溶剂为甲醇），λmax＝286；¹H>J>J>J>J>J>J>J>13C>

衍生物（A4）：(E)-2-苯基-3-(3-甲氧基-4-羟基苯基)丙烯酸

将苯乙酸和3-甲氧基-4-羟基苯甲醛混合，按照上述条件反应，最终得到白色固体，收率23.0％，熔点191.6-191.9℃；HPLC（甲醇：水＝5:5，0.06%乙酸）：保留时间8.072，含量97.1%；紫外最大吸收（溶剂为甲醇），λmax＝310；¹H>J>J>J>J>J>13C>

衍生物（A5）：(E)-2-苯基-3-(4-羟基苯基)丙烯酸

将苯乙酸和对羟基苯甲醛混合，按照上述条件反应，最终得到白色固体，收率10.0％，熔点231.7～232.1℃；紫外最大吸收（溶剂为甲醇），λmax＝286；¹H>J>J>J>J>J>13C>

衍生物（A6）：(E)-2-(4-甲磺酰基苯基)-3-(4-羟基苯基)丙烯酸

将4-甲磺酰基苯乙酸和对羟基苯甲醛混合，按照上述条件反应，最终得到白色固体，收率68％，熔点236.9～237.7℃；紫外最大吸收（溶剂为甲醇），λmax＝310；¹H>J>J>J>J>13C>

实施例2生物学试验

一、抗病毒活性的筛选

阿魏酸衍生物的体外抗病毒作用，进行常见的呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、肠道病毒71型(EV71)等抗病毒效应研究，参考文献（岳路路等，世界中医药，2018,13(01):199-206）方法，显微镜下观察细胞存活率。此部分内容，由山东省抗病毒研究中心测试。

将阿魏酸（FA）及其衍生物（A1～A6）配制成测试液。实验分为细胞对照组、病毒对照组和药物组，利巴韦林作参照品。每组设3个重复孔。药物组将阿魏酸衍生物用细胞维持液稀释，从1﹕2开始进行梯度稀释，加入到已培养好的单层细胞人喉癌细胞（Hep2）或恒河猴胚胎肾细胞（MA104）中，每孔50μL。将RSV、HSV-1病毒接种在Hep2细胞上，将EV71病毒接种在MA104细胞上，在37℃、5%CO₂无菌箱中培养，显微镜下每日观察细胞病变(CPE)，当CPE大于50%视为细胞毒性，计算得到半数中毒浓度(TC₅₀)。当CPE大于90%时终止培养，显微镜下观察其CPE，将CPE发生50%的稀释度，视为药物半数有效浓度(EC₅₀)。根据上述药物半数中毒浓度(TC₅₀)及药物半数有效浓度(EC₅₀)，按照下述公式（1）计算阿魏酸衍生物的抑毒指数(TI)，TI大于4者判为有效。实验结果，见表-1。

公式（1）：TI=TC₅₀/EC₅₀。

表1 阿魏酸衍生物对RSV、HSV-1和EV71病毒的作用

实验结果：利巴韦林对三种病毒RSV、HSV-1、EV71都具有一定的抑制作用，实验模型成功；阿魏酸（FA）对三种病毒RSV、HSV-1、EV71并无抑制作用。阿魏酸修饰改造后得到衍生物A1～A6，对RSV的抑毒指数（TI）大于4，都具有一定的抗RSV作用，其中A3的抑制作用最强，A2的抑制作用次之。这些衍生物对HSV-1和EV71的抑制效果，除A6对HSV-1具有一定的抑制效果，其他未观察到抑制作用。

二、抗氧化活性的筛选

阿魏酸衍生物对DPPH和ABTS⁺自由基清除能力的研究，参考文献（曾维才等，化工进展,2013(06):1205-1213）方法，并稍作改进。

将阿魏酸（FA）及其衍生物（A1～A6）配制成测试液。维生素C（Vc）作参照品。移液枪移取测试液50 μL置96孔板内，设两个副孔，再加入120 μg·mL^{-1>的DPPH溶液100 μL，对照组用70%乙醇代替，避光反应30 min，用多功能读板机在517 nm处测各孔的吸光度，分别记作A_测试和A_对照，按照清除率公式（1）计算DPPH清除率。移液枪移取测试液50>-1>的ABTS溶液100>测试和A_对照，按照清除率公式（2）计算ABTS清除率。实验结果，见表-2。}

公式（2）：自由基清除率（%）=[(A_对照-A_测试)/>对照]×100%。

自由基清除能力以半数抑制率（IC₅₀）来衡量，IC₅₀是指清除率为50%时的药物浓度，IC₅₀值越小其清除自由基的能力越强。IC₅₀值以浓度为横坐标，以清除率为纵坐标做回归方程来计算求得。

表2 阿魏酸衍生物对DPPH和ABTS的清除率（IC₅₀）

实验结果：维生素C（Vc）对DPPH和ABTS⁺自由基都具有良好的清除作用，实验模型成功；阿魏酸（FA）具有酚羟基，对DPPH和ABTS⁺自由基都具有良好的清除作用。阿魏酸衍生物的抗氧化作用通过半数清除率（IC₅₀）比较，IC₅₀值越小其抗氧化作用越强。阿魏酸修饰改造后得到衍生物A1～A6，其中A1、A2、A4、A5和A6都具有酚羟基，对自由基都具有一定的清除效果，尤其是A1、A2和A4具有良好的抗氧化作用。衍生物A3的酚羟基被酰化后对自由基的清除能力消失，但代谢分解后会生成A2，可以发挥抗氧化作用。

三、对心血管系统的影响

通过阿魏酸衍生物对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖及凋亡的影响，评估衍生物对心血管系统的作用，参考文献（孙永琨等，中国医学科学院学报，2009,05:538）方法，并稍作改进。将浓度为1.0×10^{5>个/mL的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）接种在96孔细胞培养板中，每孔100 μL，实验设阴性对照组、空白对照组和药物组，设 3 个复孔。将阿魏酸（FA）及其衍生物配制成溶液，稀释成不同浓度的测试液，取100μL加入相应孔中，细胞在无菌培养箱中培养24h，再用MTT法检测HUVEC细胞活力。用酶标仪在490nm处测量吸光度(OD值)，根据各组测定的OD值，按照下述公式（3）计算药物组的细胞活力。实验结果，见表-3和图-1。}

公式（3）：细胞活力（%）=[(OD_药物组-OD_空白组)/>对照组-OD_空白组)]×100%。

表3 阿魏酸衍生物对HUVEC增殖和凋亡的影响

实验结果：在人静脉血管内皮细胞（HUVEC）中，加入不同浓度的阿魏酸，用MTT法检测内皮细胞的活性，随着阿魏酸（FA）浓度的增加，细胞的存活率逐渐降低。阿魏酸衍生物以不同浓度作用于HUVEC细胞，用MTT法检测内皮细胞的活性，在0.5mg/mL以下时，细胞存活率均在90%以上，实验结果如表-3和图-1所示。随着阿魏酸衍生物的浓度增加，A1和A5对HUVEC细胞的毒性增大，存活率逐渐降低，而A3和A4使HUVEC细胞的存活率增大，反而有增殖作用。

基于以上实验结果，在本发明中阿魏酸（FA）经结构改造后，获得的阿魏酸衍生物对呼吸道合胞病毒(RSV)具有良好的选择抑制作用，衍生物A2和A3对RSV的抑制效果显著，其中A3对RSV的抑制作用最强。阿魏酸衍生物具有抗氧化作用，通过降低心血管系统的氧化损伤，有利于降低药物的心血管风险，阿魏酸衍生物除A3外对自由基都具有一定的清除作用，尤其是A1、A2和A4具有良好的抗氧化作用，而A3代谢分解后会生成A2，也可以发挥抗氧化作用。人静脉血管内皮细胞（HUVEC）实验中，阿魏酸衍生物对内皮细胞的毒性较小，尤其是A3和A4对内皮细胞具有增殖作用，表现出较低的心血管风险。综上实验结果表明，本发明的部分阿魏酸衍生物对呼吸道合胞病毒(RSV)具有选择抑制作用，对血管内皮细胞（HUVEC）表现出良好的增殖和保护作用，尤其是阿魏酸衍生物A3抗病毒效果最佳，可用于制备具有心血管病症状的患者可使用的抗病毒药物。

实施例3药物组合物制备

本发明药物组合物的剂型可以是片剂、胶囊剂、滴丸、分散片、颗粒剂、水针或粉针，实施例通过片剂和胶囊剂对本发明的内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明的范围仅限于以下实施例。

一、片剂制备

处方：衍生物A3称取1.0g，微晶纤维素称取50g，预胶化淀粉称取100g，10%PVPK30乙醇液适量，硬脂酸镁称取3g，共制备1000片。将原料和辅料分别粉碎过80目筛备用；制粒溶液制备：取PVP K30加浓度为30～95％药用乙醇制成5～10％的溶液；取原料和辅料混匀，加入制粒溶液适量制软材，20目制粒，50～70℃干燥后，18目整粒，加入硬脂酸镁混匀；测定颗粒含量，冲压片，计算片重，随机检测装量；成品全检，包装入库。

二、胶囊制备

处方：衍生物A3称取0.5g，微晶纤维素称取50g，预胶化淀粉称取100g，10%PVPK30乙醇液适量，硬脂酸镁称取3g，共制备1000粒。将原料和辅料分别粉碎过80目筛备用；制粒溶液制备：取PVP K30加浓度为30～95％药用乙醇制成5～10％的溶液；取原料和辅料混匀，加入制粒溶液适量制软材，20目制粒，50～70℃干燥后，18目整粒，加入硬脂酸镁混匀；测定颗粒含量，胶囊填充，随机检测装量；成品全检，包装入库。