鸦胆子素A在制备防治糖尿病、糖尿病肾病的药物中的应用

摘要

本发明提供了鸦胆子素A在制备防治糖尿病、糖尿病肾病的药物中的应用，属于中药制备和应用技术领域，本发明提供了鸦胆子素A新的药物应用，根据本发明实施例记载所述鸦胆子素A能够显著降低血糖，具有防治糖尿病的作用；同时所述鸦胆子素A能够抑制糖尿病肾病重要的炎症因子IL‑6和糖尿病肾病相关蛋白纤维粘连蛋白FN和四型胶原Col IV的表达，具有显著的防治糖尿病肾病的作用。

说明书

技术领域

本发明属于中药制备和应用技术领域，尤其涉及鸦胆子素A在制备防治糖尿病、糖尿病肾病的药物中的应用。

背景技术

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。国际糖尿病联盟数据显示，2017年全球成人糖尿病患者(Diabetes Mellitus，DM)已达到4.25亿，中等收入和低收入国家的糖尿病患病率上升速度更快，预计截止到2045年，糖尿病人数将达到6.29亿，从2012年到2015年，每年约有150-500万人死于糖尿病。2013年9月，《美国医学会杂志》调查数据显示，中国成人糖尿病患病率达到11.6％，糖尿病前期患病人群高达50.1％。糖尿病是失明，肾衰竭，心脑血管疾病，骨质疏松的重要诱因之一，糖尿病已被认为是世界第六大致病因素，这对个人和全球卫生经济造成了巨大的社会经济压力。

糖尿病肾病是糖尿病严重的微血管并发症，30～40％的糖尿病人患有糖尿病肾病，且相对于无糖尿病患者，1型和2型糖尿病患者患肾病的风险分别高出12倍和6倍，糖尿病伴有微量蛋白尿10年以上的患者中有50％可发展为糖尿病肾病，5～10年后即可出现终末期肾功衰竭，是导致许多西方国家患者终末期肾脏病的主要病因，也是糖尿病主要的死亡原因之一。近十几年来在我国的发病率上升，严重危害人类健康的同时造成了巨大的经济负担。

目前对于糖尿病肾病，多认为是糖脂代谢紊乱、肾脏内肾素-血管紧张素(RAS)系统激活、炎症反应及氧化应激等因素在遗传背景下相互作用的结果,引起肾小球系膜细胞增生、基底膜增厚，最终导致肾小球硬化。炎症反应贯穿于糖尿病肾病发生发展的各个过程当中，当机体处于糖尿病的病理环境中时，代谢异常和血流动力学紊乱触发了糖尿病机体大量炎症因子产生和相关通路的激活，高糖环境刺激单核细胞趋化细胞，可趋化激活多种炎症细胞(例如，T淋巴细胞、巨噬细胞)，糖尿病肾病中巨噬细胞、单核细胞、T细胞和成纤维细胞的积聚是导致炎症的主要原因。糖尿病患者的MCP-1表达与糖尿病肾病有关，其水平随着尿白蛋白排泄量的增加而增加，在自发型糖尿病db/db小鼠中，MCP-1缺乏可减弱肾小球和巨噬细胞积蓄以及肾纤维化，减轻糖尿病肾病蛋白尿的产生。

白介素-6(interleukin-6，IL-6)水平在糖尿病肾病患者血清中显著高于无肾损害的糖尿病人，IL-6对肾小球和浸润细胞具有直接作用，可影响细胞外基质动力学参数，介导肾小球基底膜增厚。纤维粘连蛋白(Fibronectin，FN)介导肾脏纤维化和肾小球硬化，在糖尿病状态下，纤维粘连蛋白呈现异常升高的趋势。四型胶原(Collagen IV，Col IV)是肾小球系膜细胞外基质的主要胶原组成成分，糖尿病肾病状态下，Collagen IV沉积在基底膜，引起基底膜增厚，介导肾小球硬化、肾小管间质纤维化，造成糖尿病肾病。

糖尿病目前还没有有效的根治方法，患者需要一直服药以减轻症状，目前的许多降血糖的药物，有些在长期使用后会产生副作用或者药效降低；血糖控制不善，引起胃肠道反应等不适，均对人造成困扰。在糖尿病肾病的治疗方面，目前现代医学治疗多从饮食控制、强化血糖控制、肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂实行降压、调整脂质代谢等方面着手，或是采用透析、肾移植等治疗手段，虽然有一定疗效，但不能阻止其发展和恶化，且给患者带来沉重的经济负担。

因此研究高效低毒安全可靠的防治糖尿病、糖尿病肾病的药物具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸦胆子素A在制备防治糖尿病、糖尿病肾病的药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了鸦胆子素A在制备防治糖尿病药物中的应用。

优选的，所述鸦胆子素A通过降低血糖来防治糖尿病。

优选的，所述防治糖尿病药物还包括鸦胆子素A药学上接受的辅料，所述鸦胆子素A在防治糖尿病药物中的质量百分含量为0.01～99.5％。

本发明还提供了鸦胆子素A在制备防治糖尿病肾病药物中的应用。

优选的，所述鸦胆子素A通过抑制肾小球系膜细胞的炎症因子Il-6的mRNA表达来防治糖尿病肾病。

优选的，所述鸦胆子素A通过抑制纤维粘连蛋白Fn的mRNA表达来防治糖尿病肾病。

优选的，所述鸦胆子素A通过抑制四型胶原Col iv的mRNA表达来防治糖尿病肾病。

优选的，所述防治糖尿病药物还包括鸦胆子素A药学上接受的辅料。

优选的，所述鸦胆子素A在防治糖尿病肾病药物中的质量百分含量为0.01～99.5％。

本发明的有益效果：本发明提供的鸦胆子素A在制备防治糖尿病、糖尿病肾病的药物中的应用，提供了鸦胆子素A新的药物应用，根据本发明实施例记载所述鸦胆子素A能够显著降低血糖，具有防治糖尿病的作用；同时所述鸦胆子素A能够抑制糖尿病肾病重要的炎症因子IL-6和糖尿病肾病相关蛋白FN和Col IV的表达，具有显著的防治糖尿病肾病的作用。

附图说明

图1为鸦胆子素A的化学结构式；

图2为鸦胆子素A对糖尿病小鼠空腹血糖的影响；

图3为鸦胆子素A对高糖诱导HBZY-1细胞的IL-6分泌的影响(#p<0.05vs HG)；

图4为鸦胆子素A对高糖诱导HBZY-1细胞Il-6、Fn、Col ivmRNA表达的影响(A：Il-6,*p<0.05vs control，#p<0.05vs HG；B：Fn；C：Col iv)。

具体实施方式

本发明中所述鸦胆子素A(BruceineA,BA)是从鸦胆子干燥果实中提取的苦木素类化合物，CAS：25514-31-2，分子式为C₂₆H₃₄O₁₁，分子量为522.53，包含一个含氧杂环，一个内酯环，化学结构式如图1所示。本发明对所述鸦胆子素的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售鸦胆子素A即可。

本发明提供了鸦胆子素A在制备防治糖尿病药物中的应用。本发明中所述鸦胆子素A通过降低血糖来防治糖尿病。本发明中所述鸦胆子素A在制备防治糖尿病药物时，可以添加鸦胆子素A药学上接受的辅料，本发明中，所述鸦胆子素A在防治糖尿病药物中的质量百分含量为0.01～99.5％。本发明对所述辅料的种类没有特殊限定，所述防治糖尿病药物的剂型优选为注射制剂。本发明中，所述防治糖尿病药物的施药剂量优选为为0.5～2mg/Kg/次，更优选为1～1.5mg/Kg/次，本发明中所述防治糖尿病药物优选的每2d施用一次，所述防治糖尿病药物的施药疗程优选为30～40d，更优选为32～38d，最优选为35d。

本发明还提供了鸦胆子素A在制备防治糖尿病肾病药物中的应用。本发明中所述鸦胆子素A在制备防治糖尿病肾病药物时，可以添加鸦胆子素A药学上接受的辅料。本发明对所述辅料的种类没有特殊限定，本发明中，所述鸦胆子素A在防治糖尿病肾病药物中的质量百分含量为0.01～99.5％。糖尿病肾病患者的肾小球系膜细胞炎症效应严重，主要表现为炎症相关因子白介素-6(IL-6)的分泌和mRNA表达上调，以及纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)、四型胶原(Collagen IV,Col IV)的mRNA表达上调。而本发明所述鸦胆子素A能够抑制肾小球系膜细胞的炎症因子Il-6的mRNA表达、抑制纤维粘连蛋白Fn的mRNA表达，抑制四型胶原Col iv的mRNA表达。可见所述鸦胆子素具有显著的防治糖尿病肾病的作用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

鸦胆子素A防治糖尿病

材料：

8周龄糖尿病模型db/db小鼠及健康对照db/m小鼠(均为SPF级)购于南京大学-南京生物医药研究院；鸦胆子素A购于南京春秋生物工程有限公司；罗氏活力型血糖仪购于瑞士罗氏公司。

动物饲养及分组：

实验小鼠于中国医学科学院医药生物技术研究所实验动物屏障系统内饲养，给予普通饲料，自由饮食、饮水，每天12h交替照明，实验已通过中国医学科学院医药生物技术研究所动物实验伦理委员会批准。

db/db小鼠30只随机分为3组，每组10只，分别为糖尿病模型组、BA低剂量组(0.5mg/kg)、BA高剂量组(2mg/kg)，设置对照组db/m小鼠10只。

给药方案：

8周龄实验小鼠分组后，对照组和糖尿病模型组分别腹腔注射相应体积生理盐水，BA低剂量和高剂量组分别以腹腔注射给予0.5mg/kg、2mg/kg BA溶液，每两天给药一次，连续给药5周(给药完成时小鼠为13周龄)。

小鼠血糖检测：

用活力型罗氏血糖仪测定实验小鼠空腹血糖。给药达到5周时，全组小鼠禁食(不禁水)6h，酒精棉擦拭小鼠尾稍消毒，剪尾法取血，按照血糖仪说明书进行血糖测定。

结果

空腹血糖结果如图2所示，发现0.5、2mg/kg BA均能显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖(图2)。说明BA具有一定的防治糖尿病作用。

实施例2

防治糖尿病肾病：

材料：

大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心；鸦胆子素A购于南京春秋生物工程有限公司；45％(g/L)葡萄糖水溶液购于美国Sigma-Aldrich公司；IL-6Rat ELISA Kit(ab100772)购于英国abcam公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒购于美国Thermo Scientific公司；Trizol试剂(15596-018)购于美国Life Technologies公司；5×PrimeScript RT MasterMix(DRR036A)购于日本TaKaRa公司；2×EasyTaq PCR SuperMix(AS111)购于北京全式金生物技术有限公司；Model 3131细胞培养箱、Nanodrop 2000c超量微生物检测仪购于美国Thermo Scientific公司；Model MG96+基因扩增仪购于杭州朗基科学仪器公司；实时荧光定量PCR系统7300FASTAppliedBiosystems购于美国AppliedBiosystems公司；Model 680酶标仪购于美国Bio-Rad公司；引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

细胞培养、分组及加药处理：

HBZY-1细胞用含10％(v/v)FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的MEM完全培养基，于37℃，5％CO₂无菌恒温培养箱中孵育培养。细胞接种后，分为对照组(不含葡萄糖)、高糖组(加35mmol/L葡萄糖处理)、BA组(10、50、100nmol/L的BA预作用2h，再加35mmol/L高糖予以刺激)，作用48h后进行相关检测。

酶联免疫吸附法(ELISA法)测IL-6的含量：

取对数生长期的HBZY-1细胞，以3×10⁵个/孔接种于6孔细胞培养板，待细胞充分贴壁后，以含0.5％(v/v)FBS的MEM培养基周期同步化24h，向BA处理组加入10、50、100nmol/L的BA，预作用2h，再向高糖组和BA处理组加入终浓度为35mmol/L葡萄糖溶液刺激，于对照组中加入同体积PBS，作用48h后，收集培养液上清，用ELISA法检测炎症因子IL-6的表达，严格按照试剂盒说明书进行操作。收集细胞裂解，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，进行蛋白均一化。

IL-6：100μl样品加入各检测孔中，贴上覆孔膜于4℃孵育过夜，1×wash buffer洗板5次，甩干，再向每孔中加入100μl1×Biotinylated IL-6Detection Antibody，贴膜于室温下孵育1h，洗板5次，甩干，向每孔加入1×HRP-Streptavidin concentrate 100μl，贴上覆孔膜于室温下孵育45min，洗板5次，甩干；向每孔加入显色工作液TMB One-StepSubstrate Reagent 100μl，室温避光显色30min，最后向每孔加入50μl终止液，立即用酶标仪在450nm波长处测定吸光度值(A)，以加入与待测样品相同体积的DMSO为对照组，计算相对IL-6水平。

qPCR法检测Il-6、Fn、ColivmRNA表达水平

取对数生长期的HBZY-1细胞，以3×10⁵个/孔接种于6孔细胞培养板，待细胞充分贴壁后，以含0.5％(v/v)FBS的MEM培养基周期同步化24h，向BA处理组加入10、50、100nmol/L的BA，预作用2h，再向高糖组和BA处理组加入终浓度为35mmol/L葡萄糖溶液刺激，于对照组中加入同体积PBS，作用48h后，用Trizol法抽提细胞总RNA，使用5×PimeScriptRTmastermix逆转录PCR获得cDNA，然后以大鼠Il-6、Fn、Col>其中△△CT＝(CT(待测样本目的基因)-CT(待测样本内标基因))—(CT(对照样本目的基因)-CT(对照样本内标基因))，得出各组相应炎症相关因子的mRNA表达水平。

表1：引物序列

结果

BA对高糖诱导HBZY-1细胞IL-6分泌的影响

IL-6与肾脏疾病，尤其是炎症的进程密切相关，ELISA检测结果显示，高糖刺激48h后，HBZY-1细胞的炎症因子IL-6的分泌水平上调；10、50、100nmol/LBA组与高糖组相比，IL-6的分泌水平呈现剂量依赖性的降低，其中100nmol/LBA的抑制作用最为显著(p<0.05)(图3)。说明BA具有抗糖尿病肾病的作用。

BA对高糖诱导HBZY-1细胞Il-6、Fn、Coliv mRNA表达的影响

IL-6、FN、Col IV是糖尿病肾病重要的炎症因子和相关蛋白，在糖尿病肾病病人的血清中含量较高。qPCR结果显示，50、100nmol/LBA可抑制高糖诱导的Il-6、Fn、Col iv表达(图4A-C)。同样说明BA具有抗糖尿病肾病的作用。

由上述实施例可知，本发明提供的鸦胆子素A具有显著的防治糖尿病、糖尿病肾病的作用，可以用于制备防治糖尿病、糖尿病肾病的药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所

<120> 鸦胆子素A在制备防治糖尿病、糖尿病肾病的药物中的应用

<160> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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