Cloning, prokaryotic expression and homology modeling analysis of midgut aminopeptidase gene PxAPN5 in Plutella xylostella (Lepidoptera:Plutellidae)

摘要

【目的】克隆和表达小菜蛾PluTEllA XylOSTEllA氨肽酶基因,并进行基因序列分析和同源建模分析。【方法】以小菜蛾中肠C dnA为模板克隆分析氨肽酶基因序列,原核表达氨肽酶蛋白并进行酶活性测定,应用配体印迹分析氨肽酶与Cry2Ab蛋白的结合,通过蛋白质建模对突变位点进行分析。【结果】从小菜蛾中肠C dnA扩增出氨肽酶基因,该基因全长2 853 bP,编码950个氨基酸,预测蛋白分子量为107.3871 k dA,等电点为5.24;进化树分析显示,克隆得到的氨肽酶基因属于APn家族5,将其命名为PX APn5(gEn bAnk登录号:kM034756)。PX APn5蛋白具有鳞翅目昆虫氨肽酶蛋白的保守性特征,即含有n-糖基化位点、O-糖基化位点和gPI锚定位点,具有“HEXXH“锌蛋白酶结构域和C端跨膜区域。在大肠杆菌ESCHErICHIA COlI中原核表达PX APn5,表达产物经SdS-PAgE电泳,在110 k dA附近出现特异性条带;酶活性测试显示菌体破碎上清液具有氨肽酶活性,比活力为1 047.2 u/g。配体印迹结果显示表达的PX APn5能与Cry2Ab蛋白特异性结合。多序列比对结果表明,与其他已报道的小菜蛾氨肽酶相比,PX APn5氨基酸序列有3个保守性位点发生了突变,并通过蛋白质建模的方式表征突变位点。【结论】本研究成功克隆和表达了具有氨肽酶活性的小菜蛾氨肽酶,并发现其能与Cry2Ab蛋白特异性结合;通过蛋白质建模对氨肽酶突变位点的特征及功能进行了预测。这些结果对小菜蛾氨肽酶的功能性研究提供了理论基础。