Estandarización de la técnica de hibridación in situ para la detección de Streptococcus agalactiae en tejidos de tilapia roja (Oreochromis sp.) y su uso potencial en estudios epidemiológicos y de patogénesis / Standardization of in situ hybridization technique for Streptococcus agalactiae detection in tilapia red tissues (Oreochromis sp.) and its potential use in epidemiological and pathogenesis assays

摘要

La estreptococosis es uno de los problemas sanitarios más importantes en la acuicultura mundial. En Colombia hasta el momento solo se ha logrado confirmar la presencia del S. agalactiae, causando importantes pérdidas en las explotaciones de tilapia. Su diagnóstico se basa en los signos clínicos, las lesiones histopatológicas y el aislamiento microbiológico; sin embargo, su identificación específica requiere de técnicas moleculares. La técnica de hibridación in situ permite no solo detectar específicamente la bacteria en los tejidos sino también observar los cambios histopatológicos en los tejidos del hospedero. En la presente investigación se estandarizó la técnica de hibridación in situ para la detección del S. agalactiae en tejidos de tilapia roja (Oreochromis spp.). Se emplearon sondas de oligonucleótidos para la detección del 16S rRNA del S. agalactiae marcadas con biotina y su detección con estreptavidina-peroxidasa. Se obtuvo la hibridación positiva en el interior de los granulomas de tejidos con lesiones y positivos a la presencia de S. agalactiae, así como en pellets de bacteria; sin embargo, a pesar de todos los ensayos llevados a cabo, no fue posible la obtención de señal en las bacterias libres en los tejidos. Se logró amplificar significativamente la señal mediante el uso de la tiramida. Se observó una especificidad del 100%. La hibridación in situ es una técnica altamente específica para la detección de S. agalactiae en tejidos de tilapia y puede ser usada en el diagnóstico y estudios de patogenésis y epidemiológicos con este microorganismo. / Abstract. The Streptococcosis is one of the most important health problems in world aquaculture. S. agalactiae is the only streptococcus specie identified in Colombia until now, causing significant losses on tilapia farms. Its diagnosis is based on clinical signs, histologic lesions and microbiological isolation, but molecular techniques are required for its specific identification. The in situ hybridization technique (HIS) allows not only to detect specifically the bacteria in the tissues but also to observe the histopathological changes in host tissues. In this research, we try to standardize the HIS technique for detection of S. agalactiae in tissues of red tilapia (Oreochromis spp.) and evaluate its potential use in epidemiology and pathogenesis assays. Oligonucleotide probes for detection of 16S rRNA of S. agalactiae labeled with biotin and detection with streptavidin-peroxidase were used. Positive hybridization was obtained within the granulomas of tissues with lesions and positive for the presence of S. agalactiae, as well as pellets of bacteria, but despite all the tests carried out, it was not possible to obtain signal in bacteria located free in tissues. By testing the technique on pellets of different Gram (+) bacteria, 100% of specificity was obtained. The usefulness of the tiramide in order to increase the signal intensity was also observed. The HIS is a high specific technique for detection of S. agalactiae in fish tissues and could be used in the diagnosis, pathogenesis and epidemiological studies.