Estudio de la expresión de calmodulina y detección de posibles cambios en transducción de señales durante los procesos de diferenciación del parásito Giardia intestinalis / Study of calmodulin expression and detection of changes in signal transduction pathways during the differentiation processes of parasite Giardia intestinalis

摘要

Giardia intestinalis es un parásito que infecta humanos. El proceso de exquistación es fundamental para que Giardia pueda infectar a un nuevo hospedero. Es un proceso biológico muy interesante, en donde la forma dormitante (quiste) detecta que las condiciones ambientales son las adecuadas para la reactivación celular. En este trabajo se estableció un método para la purificación de quistes del parásito, y se realizaron experimentos de exquistación. Se analizaron cambios en el patrón de fosforilación durante las tres fases del proceso de exquistación usando una tinción específica de fosfoproteínas. Se encontraron dos proteínas fosforiladas, y fueron identificadas usando MALDI-TOF. Además, por medio de experimentos de inhibición se estableció que la actividad serina-treonina kinasa es necesaria para que ocurra la citoquinesis en la fase final del proceso. Se analizó la vía de señalización dependiente de calcio y calmodulina en Giardia. Por un lado, se identificaron proteínas de unión a calcio de la familia EF-hand por medio de bioinformática; también se realizó un acercamiento experimental usando una tinción para proteínas de unión a calcio. Por otro lado, se clonó el gen de calmodulina del parásito y se obtuvo una proteína recombinante contra la que se desarrollo un anticuerpo altamente específico. Con el anticuerpo se realizaron experimentos de western-blot y de inmunofluoresencia, que permitieron determinar el nivel de expresión y la localización de calmodulina durante la exquistación y enqustación de Giardia. Además, usando experimentos de pull-down se aislaron e identificación por primera vez cuatro proteínas de unión a calmodulina en este organismo. / Abstract. The parasite Giardia intestinalis undergoes a differentiation process that allows it to infect its mammal host. That process is excystation. The excystation is a highly interesting biological process in which the dormant form (cyst) perceives that the environmental conditions are right for cell reactivation. We report a new method for quick and effective isolation of parasite cysts. We examined the importance of protein phosphorylation during the passage from cyst to trophozoite. Using a specific staining for phosphoproteins. We found two phosphorylated proteins and identified them with MALDI-TOF. In addition, the inhibition of serine-threonine kinases during excystation specifically affected the cytokinesis. In this study we analyzed the calcium/calmodulin signal pathway in Giardia. We used two approaches to identify calcium binding proteins. First, we analyzed its completed genome sequence for genes encoding EF-hand-containing proteins. Second, we carried out assays with a specific staining for calcium binding proteins. On the other hand, we produced a highly specific antibody against the calmodulin of the parasite which allowed us to detect the protein level on western-blot and its localization in immunofluorescence assays. This is the first report of the isolation and identification of calmodulin binding proteins in the parasite Giardia intestinalis.