Untersuchungen zum Einsatz von small interfering RNAs gegen epidermal growth factor receptor in humanen Gliomzellen

摘要

Humane maligne Gliome stellen die häufigste Form primärer Hirntumore des Erwachsenenalters dar. Ihre anatomische Lokalisation, die Infiltration des umgebenden gesunden Gehirngewebes und die Unterdrückung einer gegen den Tumor gerichteten Immunantwort tragen zu ihrem hochgradig aggressivem Phänotyp bei. Trotz intensiver Bemühungen, die neurochirurgischen, radiologischen und chemotherapeutischen Behandlungsmethoden zu verbessern, beträgt die mediane Überlebensdauer bei Patienten mit der aggressivsten Form, dem Glioblastoma multiforme (GBM) nur circa 18 Monate nach Diagnose. Maligne Gliome sind durch eine Reihe distinkter genetischer Veränderungen gekennzeichnet, wobei eine der häufigsten Aberrationen den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR, ErbB1, HER-1) betrifft. Dieser ist in 40-50% der Gliome amplifiziert, außerdem liegt häufig eine transkriptionelle Überexpression und eine Aktivierung des Signalwegs über autokrine Rückkopplungsmechanismen vor. Zudem kann die Amplifikation mit einer aktivierenden Mutation (EGFRvIII) einhergehen. Der EGFR stellt den Prototyp von Rezeptortyrosinkinasen der Klasse I dar und gehört einer Familie von vier homologen Rezeptoren (ErbB1-ErbB4) an. Die Aktivierung des Rezeptors erfolgt durch die Bindung spezifischer Liganden (z.B. EGF, TGFalpha) mit anschließender Bildung von ErbB- Homo- oder Heterodimeren und Phosphorylierung bestimmter intrazellulärer Aminosäurereste. Dadurch rekrutierte Effektormoleküle vermitteln die Aktivierung verschiedener Signalkaskaden (z.B. MAPK, PI(3)K), die zu Proliferation, Migration und erhöhten Überlebensraten der Zellen führen können. Der EGFR ist das Ziel verschiedener therapeutischer Strategien. Während kleine synthetische Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKIs) und monoklonale Antikörper die Aktivität des EGFR blockieren, inhibieren Antisense-Oligonukleotide und Ribozyme dessen Proteinsynthese. Einen alternativen Ansatz zu letztgenannten Methoden stellt die Verwendung von small interfering RNAs (siRNAs) dar. Diese 21 Nukleotide langen doppelsträngigen RNAs wurden als Bestandteile eines intrazellulären Mechanismus´ (RNA Interferenz, RNAi) identifiziert, der zur Abwehr von Viren und mobilen genetischen Elementen dient und RNA-Moleküle degradiert, die Sequenzhomologie zu den eingesetzten siRNAs aufweisen. Durch Selektion spezifischer Abschnitte der Ziel-mRNA und die Herstellung dazu homologer synthetischer siRNAs, kann die mRNA eines therapeutisch relevanten Gens, hier des EGFR, spezifisch abgebaut werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war zunächst, die zu Beginn der Untersuchungen noch völlig neuartige Anwendung von siRNAs in humanen Gliomzellen zu etablieren. Im folgenden sollte die Expression des für die Progression dieser Tumore potentiell relevanten EGFR durch spezifische siRNAs reduziert und so ein weniger maligner Phänotyp in den verwendeten Zellinien induziert werden. Der Effekt der EGFR-Regulation auf die Genexpression wurde anhand von Mikroarray-Analysen untersucht.