摘要：细菌多糖蛋白结合疫苗，尤其多价疫苗的发展，需要多种安全有效的蛋白载体，绿脓杆菌主要致病因子外毒素A作为蛋白载体，近来应用研究较多；实践证明针对该毒素免疫反应对绿脓杆菌的感染有保护力；天然毒素和基因脱毒类毒素作为蛋白载体分别利用不同的结合方法制备的结合疫功经动物试验和人体观察证明安全性，免疫原性及对结合条件的稳定性良好，展示了良好的应用前景，该毒素基因结构相对简单，蛋白功能域清楚，构建大肠杆菌分泌性高效表达体系，从菌体外周质获取蛋白分子构象正确的产物已获成功，并用于毒素或基因脱毒类毒素的制备弥补了复杂的天然毒素纯化工艺和化学脱毒方法的不足。本文提取绿脓杆菌PA103株染色体DNA为模板，用包含毒素结构基因上游信号肽起始密码子和下游终止密码子的特异引物进行PCR扩增，得到1．9kb特异性基因片段；经特异限制性内酶酶切，获得预期酶切图谱，然后通过TA克隆方法将特异PCR产物插入克隆质粒，pUC18T载体的Hinc Ⅱ位点，经PCR扩增，酶切分析后，挑取正向插入重组质粒pUAF，对插入片段两端进行序列测定；选择合酶切位点，把目的基因插入非融合表达载体pBV21温失启动子PLPR及核糖体结合序列（SD）下游，得到重组表达质粒pBAF;pBAF转化的宿主大肠杆菌DH5a,JM109于32度培养至对数生长期后迅速置于42热水浴进行热诱导；诱导开始后分时段取样测OD值及全菌体SDS－PAGE电泳，凝胶密度条带扫描，进行细菌生长，诱导时间和表达量之间的关系分析，并通过Western-blot分析，检测表达产物免疫活性；分离诱导后全菌体细胞组分进行SDS－PAGE电泳，Western-blot分析及Vero细胞毒活性观察此表达体系的分泌的情况，结果表明：PCR产物为绿脓杆菌外毒素（EPA）前体基因（信号肽及成熟肽），诱导后，pBAF转化的宿主菌生长明显受抑制，菌体新生－71kD大小的蛋白分子，表达量分别菌体蛋白的14．9％及17．5％，诱导5小时表达量最大并能和抗EPA多抗特异结合；细胞组分分析表明：细胞外周质除新生71kD大小的蛋白外，还存在一分子量较小，也能和抗EPA多抗特异结合的蛋白，并从细胞周质检测到Vero细胞毒活性，说明，此表达体系能低水平分泌rEPA到菌体周质间隙；表达产物主要以毒素前体形式存在于细胞非可溶性蛋白中，作为分泌性宿主菌DH5α略优于JM109。
