中国辽宁咽滑刃线虫的形态与分子系统学描述

摘要

[目的]2018年7月自辽宁省沈阳市枯死华山松(Pinus armandii Franch.)体内分离得到一种非常见的线虫,经光学显微镜初步观察到该线虫在枯死松树内种群单一且数量较多,为研究其与松树枯萎的关系,从形态学和分子生物学特征对该线虫进行系统的描述说明,以确定该线虫的种属,更好地进行线虫的鉴定与分类,并对咽滑刃属线虫的数据库进行补充,便以期为松树枯萎病的相关研究提供理论参考.[方法]将采集到的华山松枯死木样品劈成1 cm(长)×1 cm(宽)的薄片,采用贝尔曼漏斗法在室温条件下分离8～12 h后收集线虫液,于光学显微镜下观察.同时将分离到的线虫用4％ 的甲醛溶液浸泡法杀死并立即固定,制作永久玻片.将一定数量的线虫用无菌水漂洗3次后移入长满灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar)培养基中,置于培养箱25°C暗培养7 d后可得到大量线虫.利用光学显微镜观察拍摄雌成虫和雄成虫的形态特征,采用De Man公式进行形态测计,并依据特征绘制出墨线图.扫描电子显微镜则用于观察线虫的侧区、唇区、阴门区、尾尖突等部位处的细微差别.提取线虫DNA并对其18S和28S D2—D3进行片段扩增、克隆和测序,多基因串联构建进化树,通过Bootstrap值分析聚类可靠性.经系统的形态学观察、测计以及分子生物学系统发育分析对该线虫进行种类鉴定.[结果]该线虫能以真菌为食,主要形态特征为雌虫体长1252～1722μm,角质层具环纹;唇区圆形,缢缩明显;口针长12～16μm,具有明显的基部球;中食道球长卵圆形近圆形,瓣膜清晰;排泄孔通常位于中食道球后方;食道腺长叶状,从背面覆盖肠;卵巢前伸,卵母细胞呈单行排列;侧线数量为4,具阴门盖;尾部具单个茎状末端,附两个梗节,分别具4～6个端缘指状突起;雄虫体长略短,为972～1383μm,体前部特征与雌虫相似;单精巢前伸,交合刺呈玫瑰刺状,长24～30μm,具2对尾乳突;尾部形态与雌虫相似,但更向腹面弯曲.系统发育分析基于核糖体RNA(rRNA)的18S和28S D2—D3基因序列,多基因串联序列构建的系统进化树也表明该线虫种群与基因库中具有可用序列的其他咽滑刃属线虫物种分开聚类.[结论]该线虫鉴定为辽宁咽滑刃线虫(Laimaphelen?chus liaoningensis n.sp.),在形态特征方面通过具有阴门盖、4条侧线和尾端梗节的特征将其与其他类似种区分开来,在分子特征方面则通过与该属中其他种类分开聚类进行区分.这是中国关于咽滑刃属线虫的首次报道,同时华山松也为该属线虫的一新寄主.在实验室条件下用灰葡萄孢成功培养了该线虫,表明该咽滑刃线虫能以真菌为食.咽滑刃属线虫的尾端结构在不同种间存在差异,只有借助扫描电镜才能观察到特征上的细微差别,说明仅基于光学显微镜的形态分类学鉴定面临一定困难,扫描电镜是观察线虫细微的尾尖形状和结构所必需的.