p53反义RNA对人肺癌细胞表型和顺铂敏感性的影响

摘要

目的：研究外源P53反义RNA对有P53基因248密码点突变的人肺癌细胞系恶性表型和顺铂敏感性的影响。方法：构建反义P53cDNA真核细胞表达载体，PEGFP－P53（AS），经酶切图证明反向联结质粒，Lipofectin介质转染有P53基因248密码点突变的人肺癌细胞系801－D，经G418筛选获耐受克隆，稀释法建立单细胞克隆系，PCR检测外源基因，荧光显微镜检测细胞绿荧光蛋白表达，P53单抗免疫组化染色检测P53突变蛋白表达，体外集落形成，检测细胞恶性生长。流氏细胞仪检测细胞周期，MTTI地检测细胞对顺铂药物敏感性。结果：酶切图证明了P53－cDNA反向联结于质粒，构建了PEGFP－P53（AS），建立了转染单细胞克隆系PEGFP－P53（AS）－801D及空载细胞系PEGFP－801D。PCR检测外源P53基因和neo基因存在于转染细胞PEGFP－P53（AS－801D。荧光显微镜下发现胞浆有绿荧光蛋白表达，免疫组化染色P53突变蛋白801D细胞系为阳性，而PEGFP－P53（AS）－801为阴性，证明外源反义P53封闭转染细胞内源突变蛋白表达。与母系相比PEGFP－P53（AS）－801D集落形成抑制率为61％（P＜0．01），流氏细胞仪检测PEGFP－P53（AS）－801D细胞G1期细胞数明显增加，出现G1期阻止的表现，MTT检测PEGFP－P53（AS）－801D对顺铂比母系更为敏感。结论：有P53基因248密码点突变的801D细胞恶性增殖明显，对顺铂耐药，外源P53反义RNA可封闭突变蛋白表达，抑制801D细胞体外恶性增殖，增加对顺铂的药物敏感性，证明P53突变的恶笥表型可以被抑制或野生型P53功能可得到恢复。