基于荧光数据计算蛋白质-配体结合常数的方程的对比及应用研究

摘要

蛋白质和配体的结合作用在生物体的生理生化过程中具有重要作用,是诸多领域的研究热点.研究蛋白质-配体结合作用的一个关键目标,就是获得两者的结合常数(Kb)以评价其结合作用的强弱.荧光光谱法具有灵敏度高、方便快速及成本低的优点,被广泛用于蛋白质-配体结合作用的研究中.应用荧光光谱法时,借助函数方程对荧光数据进行数学分析来得到Kb值是一个关键步骤.而因不同方程的适用范围不同,应用于同一体系所获得的Kb值往往存在差异.针对此问题,一方面讨论了利用荧光光谱数据计算蛋白质和配体结合的Kb值的函数方程的推导过程及其适用条件,总结出不同前提条件下蛋白质-配体1:1和1:n(n≥2)结合时可选择的计算K b值的最优方程.分析表明,选择最优方程应基于两个前提:a:蛋白质与配体结合后形成的复合物是否产生荧光;b:添加的配体浓度是否远大于蛋白质浓度.另一方面,以人血清白蛋白(HSA)-诺氟沙星(NFX)结合体系作为模型,对比了由不同方程拟合得到的Kb值的差异并探讨了相应原因.结果表明,HSA与NFX为1:1结合,利用最适用该体系的方程(S12)拟合得到其在298 K下的Kb值为5.0×104 L·mol-1,而使用方程(S6)和方程(S24)拟合得到的Kb值分别比该值大28.8％ 和48.6％,由方程(S17)得到的值则比该值约高2个数量级.这直观地展示了选择不适用的方程对所获结果的影响.此外,将利用荧光光谱法获得的Kb值与其他方法获得的数据做了对比,说明了利用荧光光谱法计算蛋白质-配体Kb值的相对可靠性,同时也指出了该方法的局限性.结果表明,在利用荧光光谱数据获得蛋白质-配体结合的Kb值时,依据前提条件(即假设a和/或b是否成立)来选取最适合的函数方程是非常必要的,其将决定所得结果的可靠性.