逆转录病毒载体介导的SynNotch门控系统构建

摘要

目的构建一种逆转录病毒载体介导的SynNotch门控系统。方法对逆转录病毒载体进行设计改造,在其两端插入绝缘子序列(insulator),并基于Gal4/UAS基因表达调控系统进行SynNotch门控系统的构建。首先采用逆转录病毒载体分别构建仅含有Gal4-VP64融合蛋白转录调控元件的门控质粒以及含有UAS激活序列的效应质粒,效应质粒使用绿色荧光蛋白(EGFP)及荧光素酶(luciferase)作为报告基因,共分为6种,其中三种为正向序列设计,将UAS序列以及报告基因正向插入逆转录病毒载体中(5’~3’),分别包括正向无绝缘子、正向单绝缘子、正向双绝缘子;另三种为反向序列设计,将UAS序列以及报告基因反向插入逆转录病毒载体中(3’~5’),分别包括反向无绝缘子、反向单绝缘子、反向双绝缘子。测序成功的质粒进一步通过病毒包装制备病毒载体,包括门控载体和效应载体。PCR法检测逆转录病毒滴度。将病毒载体转导入293T细胞,效应载体单独转导的293T细胞作为未诱导组,门控载体与效应载体共转导的293T细胞作为诱导组,分别通过流式细胞术及荧光素酶化学发光实验检测两组报告基因的表达效率。结果逆病毒载体滴度均在107~108拷贝/mL之间,且不低于阳性对照。流式细胞术的检测结果显示,正向设计的三种效应载体在未诱导的情况下EGFP的表达效率分别为95.5%、69.7%、76.2%,诱导后EGFP的表达效率分别为99.9%、95.3%、97.1%。反向设计的三种效应载体在未诱导的情况下EGFP的表达效率分别为0.085%、0.610%、7.400%,诱导后EGFP的表达效率分别为59.900%、77.900%、89.500%。荧光素酶化学发光实验的检测结果显示,正向设计的三种效应载体在未诱导的情况下luciferase表达的荧光强度均在104以上,诱导后荧光强度均在105以上;反向设计的三种效应载体在未诱导的情况下luciferase表达的荧光强度均在3×103以下,诱导后荧光强度均在104以上,诱导前后荧光强度比较,P<0.01,其中反向双绝缘子设计诱导后荧光强度可达到105以上。结论成功构建了一种逆转录病毒载体介导的SynNotch门控系统。