双启动子shRNA干扰的协同效应

摘要

目的 构建含有两段不同靶特异干扰序列的双启动子shRNA载体,并比较其与单个靶特异干扰序列的shRNA载体的干扰效应.方法 通过PCR方法扩增H1启动子序列,构建含有U6和H1双启动子的shRNA载体,命名为PLKO.1-H1.设计2对针对EGFP基因不同位点的shRNA片段,同时设计2对无干扰作用的片段shS1和shS2作为对照.分别构建携带上述片段的慢病毒表达载体shEGFP1-H1-shS2、shS1-H1-shEGFP2及shEGFP1-H1-shEGFP2,同时以shS1-H1-shS2质粒作为对照.将重组质粒转染293t细胞,收集病毒感染Hela/EGFP细胞.比较各组之间细胞的荧光强度,并以Western blot检测EGFP的蛋白表达情况.结果 成功构建含有双启动子的shRNA慢病毒表达载体.实验组与对照组相比,EGFP蛋白表达水平明显下调,以shEGFP1-H1-shEGFP2重组质粒干扰效应最强.结论 含有两段不同靶特异干扰序列的双启动子shRNA载体存在协同干扰效应.