稳定表达HMGA2的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231构建

摘要

目的 构建人乳腺癌MDA-MB-231细胞人类高迁移率族蛋白A2(HMGA2)稳定表达株.方法 取对数生长期MDA-MB-231细胞,提取细胞总RNA,逆转录含HMGA2基因的cDNA;以cDNA为模板,根据其CDS序列设计含有EcoR1、BamH1限制性内切酶位点的引物序列,采用PCR法扩增出带有双酶切位点的HMGA2目的基因;采用双酶切法将目的片段连接到慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Puro中,获得重组的pLVX-HMGA2表达载体.pLVX-HMGA2表达载体、包装质粒共转染人肾上皮细胞系293T,提取携带HMGA2的重组慢病毒.采用菌液PCR、重组质粒双酶切、质粒PCR验证及测序比对鉴定获得的重组质粒.取适量对数生长期MDA-MB-231细胞,分为两组,观察组、对照组分别感染重组慢病毒Plv-HMGA2、空载慢病毒Plv-Vector,感染48 h加入1μg/mL嘌呤霉素筛选.分别采用实时荧光定量PCR法、Western blotting法检测细胞HMGA2 mRNA、蛋白.结果 观察组、对照组细胞HMGA2 mRNA相对表达量分别为10273.93±4290.77和1.18±0.81,二者比较,P<0.05.观察组、对照组细胞HMGA2蛋白相对表达量分别为1.570±0.080和0.110±0.002,二者比较,P<0.05.结论 成功构建MDA-MB-231细胞HMGA2稳定表达株.