家蚕BmCaspase-8-Like (BmCasp8L)的免疫负调控功能

摘要

[目的]在个体和细胞水平上探讨家蚕(Bombyx mori)BmCaspase-8-Like (BmCasp8L)的免疫负调控功能,为研究昆虫免疫负调控机制提供参考.[方法]通过RT-PCR技术克隆BmCasp8L并进行结构域预测和进化分析;利用荧光定量PCR检测BmCasp8L在家蚕各龄期、5龄第3天及预蛹期各组织中的时空表达特征和家蚕感染细菌后的免疫诱导表达特征;合成用于RNAi的dsRNA,通过注射dsRNh在个体中降低BmCasp8L的表达水平,并检测对抗菌肽基因表达水平的影响;构建BmCasp8L的细胞表达载体,通过质粒或dsRNA的转染在BmE细胞中过表达BmCasp8L或降低BmCasp8L的表达水平,并利用Western blot或定量PCR予以确认,同时检测抗菌肽基因表达水平的变化及转录因子BmRelish的切割.[结果]BmCasp8L与鳞翅目Caspase-6、哺乳动物Caspase-8同源,其序列与BmDredd、DmDredd N端分别具有61％、42％的相似性,但缺少C端的Caspase结构域.时空表达特征分析表明,BmCasp8L在眠蚕期表达量高于起蚕期,在预蛹期、蛹第7天、蛾第1天表达量明显升高;在5龄第3天幼虫体内,BmCasp8L在血细胞中的表达量明显高于其他组织,而在预蛹期,BmCasp8L主要在丝腺中表达.免疫诱导表达谱显示,5龄第3天家蚕在注射感染黑胸败血芽孢杆菌或粘质沙雷氏菌1 h内,BmCasp8L的表达水平上升,此后逐渐恢复正常.对5龄第2天家蚕注射dsCasp8L或dsEGFP,24h后通过荧光定量PCR检测到BmCasp8L的表达量在注射dsCasp8L的家蚕中显著下调,而抗菌肽BmCecropinA1的表达水平显著上调.在BmE细胞中过表达BmCasp8L,抗菌肽BmCecropinA1的表达水平与对照相比显著降低,且转录因子BmRelish的切割受到抑制.在细胞中转染dsRNA后,BmCasp8L的表达水平被有效降低,抗菌肽BmCecropinA1的表达水平显著上调.[结论]进化分析、表达特征以及细胞和个体上的功能研究表明BmCasp8L是一个具有免疫负调控作用的分子,通过抑制BmRelish的切割,抑制抗菌肽的表达,从而负调控Imd信号通路,降低BmCasp8L的表达水平则导致抗菌肽表达水平升高,有助于家蚕抵御微生物病原的侵染.