重组鲍鱼肌肉脯氨酰内肽酶的性质研究

摘要

为研究皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)中脯氨酰内肽酶(Prolyl endopeptidase,Hdh-PEP)的酶学特性与结构特性,利用基因工程技术重组并在大肠杆菌中高效表达了皱纹盘鲍PEP.原核表达的Hdh-PEP分子量为85kDa,在pH2～6、温度20～60°C条件下,Hdh-PEP的表面疏水性明显升高.氨基酸序列同源性分析结果表明,Hdh-PEP催化结构域中有三个高度保守的氨基酸序列:Seq 1:K-D-G-T-K/R-I-P、Seq2:Y-G-Y-G-G-F和Seq 3:I-R-G-G-E-Y/F.酶动力学研究表明,Hdh-PEP的米氏常数Km为5.32 μmol/L,催化常数kcat值为15.7 s-1.PEP的特异性抑制剂SUAM-14746和ZPP对Hdh-PEP酶活力具有强抑制作用,丝氨酸蛋白酶抑制(PMSF)对Hdh-PEP酶活力也有较大程度的抑制作用.本实验制备了高特异性抗Hdh-PEP多克隆抗体,可检测鲍鱼肌肉中天然PEP的存在情况.Hdh-PEP的体外高效表达和特异性多克隆抗体制备为后续深入研究Hdh-PEP的性质提供了重要参考.