NLS-RARα蛋白相互作用蛋白的筛选与验证(英文)

摘要

急性早幼粒细胞白血病(APL)具有特征性染色体易位,产生的PML-RARα融合基因在其发生发展中有重要作用.PML-RARα融合蛋白在细胞内被中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)切割为PML突变蛋白(核定位信号NLS缺失)和RARα突变体(NLS-RARα,包含有PML的核定位信号),这两段蛋白质在APL的发生中可能具有重要作用.为进一步研究NLS-RARα的生物学功能,运用酵母双杂交技术在白血病cDNA文库中筛选与其作用的蛋白质.首先PCR技术扩增NLS-RARα编码序列,克隆至诱饵载体pGBKT7,测序鉴定后将其转化酵母AH109.免疫印迹检测到诱饵蛋白表达后,将含有诱饵载体的AH109与含有白血病cDNA文库的酵母Y187交配,在含有X-α-gal的营养缺陷性培养基上选择和筛选二倍体酵母.经回转实验和测序分析验证得到8个与NLS-RARα相互作用的蛋白质.为进一步验证这些相互作用,克隆其中的JTV-1蛋白,利用间接免疫荧光,GSTpull-down和免疫共沉淀技术成功验证了它与NLS-RARα的相互作用.为进一步探讨APL的发生机制提供了新的线索.