Wnt/β－连环素与细胞外调节蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶信号通路介导脑源性神经营养因子促进诱导多能干细胞分化为神经干细胞的研究

摘要

目的探讨Wnt/β-连环素（β-catenin）和细胞外调节蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）信号通路在脑源性神经营养因子（BDNF）促进诱导多能干细胞（iPSCs）分化为神经干细胞（NSCs）中的作用及相关机制。方法 iPSCs传代培养、鉴定, BDNF和维甲酸（RA）诱导iPSCs分化为NSCs, 流式细胞仪检测巢蛋白（Nestin）阳性细胞率。应用小分子RNA干扰技术（siRNA）分别沉默β-catenin及ERK1/2基因, 并将iPSCs分为BDNF组（添加10 μg/L BDNF）、siRNA-ERK/BDNF组（转染siRNA-ERK并添加10 μg/L BDNF）、siRNA-β-catenin/BDNF组（转染siRNA-β-catenin并添加10 μg/L BDNF）及空白对照组分化培养, 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blotting法检测各组Wnt/β-catenin和ERK/MAPK信号通路关键因子β-catenin、ERK1/2及下游转录因子c-fos、c-jun、c-myc的表达。组间两两比较用最小差值显著法进行分析。结果免疫荧光染色显示iPSCs表达八聚体转录因子（Oct4）、胚胎干细胞转录蛋白（Sox2）及干细胞关键蛋白Nanog等多潜能标志物。流式细胞仪检测显示BDNF诱导iPSCs分化为NSCs的Nestin阳性细胞率为78.7%, 而以RA为诱导剂的Nestin阳性细胞率为43.5%, 不含诱导剂自然分化的Nestin阳性细胞率仅为7.8%。与对照组相比, BDNF组中β-catenin、ERK1/2、c-fos、c-jun及c-myc的mRNA表达明显上调（t=2.805、2.318、2.255、1.799、1.582、1.663, 均P＆0.05）, 蛋白表达也明显上调（t=2.805、2.318、2.255、1.799、1.582、1.663, 均P＆0.05）。与BDNF组相比, siRNA-ERK/BDNF组中ERK1/2的mRNA及蛋白表达均明显下调（t=1.917、2.042、1.673、1.540, 均P＆0.05）, c-fos、c-jun的mRNA及蛋白表达出现部分下调（t=1.022、0.907、0.848、0.801, 均P＆0.05）, 而β-catenin及c-myc的mRNA及蛋白表达无明显改变（t=0.216、0.185、0.097、0.112, 均P＆0.05）;siRNA-β-catenin/BDNF组中β-catenin及c-myc的mRNA及蛋白表达明显下调（t=3.104、2.774、2.235、1.911, 均P＆0.05）, 而ERK1/2、c-fos及c-jun的mRNA及蛋白表达仅出现部分下调（t=0.776～1.192, 均P＆0.05）。结论 BDNF通过激活Wnt/β-catenin和ERK/MAPK信号通路促进iPSCs分化为NSCs, c-fos及c-jun是两条通路共同的核内转录因子, 两条通路之间可能存在交互作用。