重组脂联素融合蛋白的表达及其生物学活性测定

摘要

目的 表达重组脂联素融合蛋白(adiponectin-Trx),并测定其生物学活性.方法 从小鼠脂肪组织提取总RNA,应用序列特异性引物经RT-PCR方法扩增获得全长脂联素基因序列,克隆至pGEM-T载体,序列经DNA测序证实.将目的 序列(18-247氨基酸)亚克隆至pET-32(a)表达载体,重组质粒adiponectin/pET32(a)的序列经测序证实.将adiponectin/pET32(a)转化表达宿主菌OrigamiTM(DE3),在27℃以1mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达目的 蛋白,SDS-PAGE和氨基酸测序检测目的蛋白的表达,目的 蛋白经组氨酸镍螫和树脂亲和纯化.以不同浓度的融合蛋白adiponectin-Trx和Trx蛋白处理体外培养的人脐静脉内皮细胞,细胞增殖法测定其生物学活性.结果 小鼠脂肪组织脂联素基因的编码序列,337位点上的碱基A被C置换,导致在113位的蛋氨酸被缬氨酸取代.序列测定表明,构建的重组表达载体adiponectin/pET32a序列完全正确,诱导工程菌主要表达可溶性的融合蛋白adiponectin-Trx,部分以包含体形式表达.表达产物的相对分子量(Mr)同预期分子量相同,adiponectin-Trx Mr为43 000,Trx Mr为19 000.在低浓度时融合蛋白刺激人脐静脉内皮细胞增殖.结论 小鼠脂肪组织脂联素基因编码序列与来自3T3-L1脂肪细胞的编码序列不同.成功地在E.coli中表达了重组脂联素融合蛋白并具有生物学活性.