噬菌体PaP3推定基因tls核酸内切酶活性的初步验证

摘要

目的对BLAST推定的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的tls基因功能进行实验验证.方法采用PCR方法从噬菌体PaP3基因组扩增出tls基因,克隆至pMD18-T载体中,再经酶切纯化后将目的基因插入表达载体pQE31,转化入大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达目的蛋白,超声裂菌后收集包涵体,并用裂解缓冲液溶解包涵体蛋白.然后利用Ni-NTA亲合层析纯化蛋白,通过透析使H6-TLS复性.最后构建含有末端酶大亚基酶切位点的底物质粒pMD-cos,检测复性蛋白活性.结果通过上述方法,成功构建了pQE-tls表达载体,融合蛋白H6-TLS表达量占菌体总量的30%.同时成功构建了目的蛋白的底物质粒pMD-cos.经由亲和层析初步纯化及透析复性后,H6 TLS可检测出核酸内切酶的活性,能将底物质粒部分线性化.结论成功地获得了具有内切酶活性的H6 TLS融合蛋白,为tls基因的认证提供了实验证据,为进一步鉴定和利用该基因奠定了基础.