ABH1融合蛋白表达载体的构建及表达纯化

摘要

目的:构建ABH1重组蛋白原核表达载体及建立ABH1蛋白纯化技术。方法:应用PCR技术从人的cD-NA文库扩增出ABH1基因片段,并加入限制性内切酶位点和终止子,进而将其插入到原核表达质粒pET-15b中,构建ABH1/15b原核表达克隆,最后用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,用镍柱亲和纯化,离子交换层析及凝胶过滤层析三步法纯化ABH1蛋白,并采用电泳迁移率实验(EMSA)检测所纯化蛋白的DNA结合活性。结果:PCR鉴定和诱导表达阳性结果表明ABH1基因被成功构建入载体pET-15b中,测序分析显示,插入片段全长为1189bp,插入位点、终止位点及阅读框都完全正确。经IPTG诱导表达和纯化后,从转入ABH1/15b质粒的BL21菌株中提取并纯化了45000的ABH1融合蛋白,经EMSA检测ABH1是一个核酸结合蛋白。结论:成功构建了重组ABH1/15b的原核表达载体,最终得到了高纯度蛋白,为进一步研究ABH1的功能和活性机制提供了实验材料。