农杆菌介导的香榧幼胚遗传转化体系

摘要

【目的】以香榧Torreya grandis‘Merrillii’幼胚为受体材料,开展农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的遗传转化研究,揭示影响香榧遗传转化的关键因素,以建立农杆菌介导的香榧幼胚遗传转化体系。【方法】以香榧种子突破种鳞后第8周至第11周的幼胚作为转基因受体材料,比较受体胚龄、农杆菌菌液浓度、侵染时间、抗生素质量浓度对遗传转化效率的影响,并采用潮霉素、绿色荧光蛋白GFP表达及GFP基因聚合酶链式反应对遗传转化香榧幼胚培养物进行阳性筛选。【结果】随着胚龄的增加,香榧幼胚抗逆性增强,污染率降低,成活率提高,第10周和第11周幼胚成活率分别为52.1%和52.3%。农杆菌菌液浓度和侵染时间均对香榧幼胚的污染率、成活率、愈伤组织诱导率以及体胚发生率具有显著影响(P<0.05)。菌液吸光度[D(600)]为0.5时,香榧幼胚愈伤组织诱导率和体胚发生率最高,分别为17.9%和17.3%;侵染时间为10 min时,愈伤组织诱导率和体胚发生率为最高,分别达17.5%和17.1%。羧苄青霉素对于受体材料的农杆菌脱除具有显著影响(P<0.05),当羧苄青霉素质量浓度为300 mg·L^(-1)时,成活率、愈伤组织诱导率和体胚发生率均最高,分别为60.5%、15.8%和17.5%。潮霉素对于香榧幼胚培养物的阳性筛选具有良好的效果,当潮霉素质量浓度为100 mg·L^(-1)时,成活率为30.5%。【结论】不同胚龄香榧幼胚遗传转化效果不同,突破种鳞后第10周香榧幼胚遗传转化效果良好;当农杆菌菌液D(600)为0.5,侵染时间为10 min时,转化效果最佳;300 mg·L^(-1)为羧苄青霉素脱除农杆菌的最佳质量浓度;100 mg·L^(-1)是潮霉素阳性香榧幼胚筛选的最佳质量浓度。图3表5参37。