汉滩病毒糖蛋白与人溶酶体相关膜蛋白重组真核表达载体的构建表达鉴定及作为基因疫苗的免疫安全性评价

摘要

目的:利用pVAX1真核表达载体构建汉滩病毒糖蛋白Gn及Gc与人溶酶体相关膜蛋白LAMP分子的重组真核表达载体,鉴定其在人真核细胞系HeLa中的表达.大量抽提去内毒素质粒,皮下注射Balb/c小鼠后初步对目标载体作为基因疫苗进行安全性评价.方法:利用PCR的方法分别以汉滩病毒编码糖蛋白M片段的cDNA为模板,扩增目的基因Gn和Gc,构建重组真核表达载体pVAX-Gn、pVAX-LAMP/Gn、pVAX-Gc和pVAX-LAMP/Gc,并进行酶切鉴定和Sanger测序.同时构建带有EGFP标签的四种重组质粒,LipofectamineTM 2000脂质体将重组质粒瞬时转染HeLa细胞,通过荧光显微镜观察结合免疫荧光检测目的蛋白的表达.抽提高纯度去内毒素的重组质粒,采用皮下注射免疫小鼠,并取重要脏器进行组织学分析.结果:双酶切鉴定和测序结果证实目的基因Gn、LAMP/Gn、Gc和LAMP/Gc成功克隆入真核载体pVAX 1,基因与原序列一致.荧光显微镜观察连有EGFP的表达载体转染的HeLa细胞,可见明显的绿色荧光,瞬时转染后特异性抗体免疫荧光检测到目的蛋白的表达.安全性评价结果显示Balb/c小鼠耐受性良好,多次注射后无明显组织形态学改变.结论:成功构建了重组嵌合载体pVAX-Gn、pVAX-LAMP/Gn、pVAX-Gc和pVAX-LAMP/Gc,并在真核细胞系中表达出目的蛋白,免疫小鼠显示了良好的安全性,为后期对汉滩病毒的靶向基因疫苗的研究奠定了基础.