沉默组织因子重组腺病毒的构建和胰岛中沉默效果检测

摘要

目的 构建复制缺陷型重组腺病毒介导短发夹RNA(shRNA):干扰组织因子(TF)在胰岛表达.方法 设计并合成四对单链寡核苷酸(ss oligo),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligo)插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后经脂质体介导入成人胰岛,通过实时定量RT-PCR方法筛选对TF沉默效果最佳穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒行同源重组.筛选出正确重组子,用293A细胞包装出表达TF-shRNA的复制缺陷型重组腺病毒并测定其病毒滴度.通过实时定量RT-PCR腺病毒沉默TF效果予以检测.结果 测序结果提示所构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确,并从四对ds oligos筛选出对组织因子沉默效果最佳的穿梭质粒pENIR/U6-shRNA,经同源重组后成功构建了介导shRNA-TF复制缺陷型重组腺病毒.转染胰岛后,通过实时定量RT-PCR方法检测发现shRNA-TF腺病毒感染胰岛后对TF mRNA的沉默效果4 d后达最佳效果,为54.29%(P＜0.05 vs NC).结论 成功构建的介导shRNA复制缺陷型重组腺病毒可以体外抑制胰岛细胞中组织因子的表达.