水稻GS3蛋白及其与Gβ蛋白复合物的表达及结晶初筛

摘要

【目的】阐明GS3蛋白在水稻中的调控机制,为解析植物G蛋白的结构及完善G蛋白的调控网络打下基础。【方法】分别采用表达载体pGEX-6p-1和pET-28b-sumo诱导表达GS3蛋白N端结构域OSR和GS3蛋白C端结构域,再使用凝胶过滤柱Superdex 200/75 10/300和阴例子交换层析柱Mono Q 5/50纯化表达蛋白,通过筛选优化晶体和X射线衍射的方法对GS3及GS3与Gβ共表达复合物的结构进行研究。【结果】将构建的重组蛋白OSR-pGEX-6p-1与GβN-pET-28b-sumo转入大肠杆菌BL21（DE3）中共表达,经GSTbeads亲和层析可获得2条条带,分别为OSR-GST（31kD）和GβN-sumo（26 kD）,再过Ni2＋beads亲和层析同样有2条条带,而SDS-PAGE凝胶电泳结果显示有4条条带,分别为GST（26kD）、sumo（17kD）、GβN（9kD）和OSR（5kD）。经阴例子交换层析柱MonoQ5/50分离纯化可获得GβN（9kD）和OSR（5 kD）二者的复合物。将纯化后的复合物浓缩至12 mg/mL进行晶体初筛,但未获得结晶。【结论】GS3和Gβ互作是通过GS3蛋白N端结构域OSR与GβN端结构域的结合而实现,其结果符合经典的G蛋白异源三聚体模型。