马氏珠母贝TLRP基因克隆及其功能研究

摘要

【目的】明确马氏珠母贝TLRP基因(PmTLRP)的组织表达特征及哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)刺激、植核及脂多糖(LPS)刺激后的时序表达特点,为进一步研究TLRs在马氏珠母贝中的免疫机制打下基础。【方法】采用RACE克隆PmTLRP基因c DNA序列,通过ProtParam、ProtScale、SignalP 4.0、TMHMM v.2.0、SMART、SoftBerry Psite和SOPMA等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测PmTLRP基因在马氏珠母贝各组织中及经哈维氏弧菌、植核及LPS刺激后的表达情况。【结果】PmTLRP基因cDNA序列全长2214 bp,包含33 bp的5’非编码区(5’-UTR)、135 bp的3’非编码区(3’-UTR)及2043 bp的开放阅读框(ORF),共编码681个氨基酸残基;其编码蛋白含有信号肽、富含亮氨酸重复序列(LRRs)、跨膜结构域和TIR结构域,符合TLRs家族所具有的特征;PmTLRP氨基酸序列与其他物种的TLRs氨基酸序列存在一定相似性,其中与美洲牡蛎TLP氨基酸序列的相似度较高。PmTLRP基因在马氏珠母贝外套膜、血淋巴、肝胰腺、鳃、性腺和闭壳肌中均有表达,以在肝胰腺中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05)。在哈维氏弧菌刺激下,PmTLRP基因在血淋巴中的相对表达量于注射刺激后12 h开始上调,至注射刺激后16 h达最大值,约是注射刺激前(0 h)的19.0倍。经植核刺激后,PmTLRP基因相对表达量在植核后5~20 d呈逐渐上升趋势,于植核后30 d达最大值,约是植核前(0 h)的6.4倍。在LPS刺激下,PmTLRP基因在血淋巴中的相对表达量先上升后下降,至注射刺激后3 h达最大值,约是对照组的5.0倍;PmTLRP基因在肝胰腺中的相对表达量呈升高→降低→升高→降低→升高的波动变化趋势,至注射刺激后24 h相对表达量上调到最大值,约是对照组的6.0倍。【结论】PmTLRP基因在马氏珠母贝外套膜、血淋巴、肝胰腺、鳃、性腺和闭壳肌中均有表达,但表达水平存在差异,经哈维氏弧菌、植核及LPS刺激后呈明显上调表达趋势,说明TLRP在马氏珠母贝的免疫防御反应中扮演重要角色。