重组人铜锌超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的表达研究

摘要

目的:构建人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)原核表达载体并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白,为其临床应用奠定基础.方法:根据已报道的hCu,Zn-SOD基因序列,采用RT-PCR技术从外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中获得SOD cDNA序列.将所得的PCR产物插入原核表达载体pET22b(+)中,重组质粒经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将其转化至大肠杆菌Rosseta (DE3),通过异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside,IPTG)诱导表达出目的蛋白,经镍固定金属亲和层析纯化.采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD生物学活性.结果:序列分析表明SOD基因成熟肽编码区含有465 bp与GenBank (X02317)中已报道序列一致的SOD核苷酸.经IPTG诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析显示表达的目的蛋白分子量约为19 kD,免疫印迹分析显示其与商品化的His-tag抗体呈特异性反应,但主要以包涵体形式表达,可溶性蛋白表达量很少.经Ni2+-NTA琼脂糖纯化获得SDSPAGE电泳下单一条带.可溶蛋白酶活力为460 U/ml(SOD的酶比活力为630 U/mg).结论:在大肠杆菌中获得了人源SOD的高效表达,为研究其生物学功能及广泛应用奠定了基础.