6-OHDA诱导的帕金森病小鼠表现出以p16Ink4a上调和星形胶质细胞衰老为特征的衰老表型

摘要

目的·探索6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的帕金森病小鼠模型是否具有衰老表现及胶质细胞的衰老变化。方法·将30只雄性9~10月龄C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(Sham组)和6-OHDA组,每组15只。通过6-OHDA纹状体立体定位注射建立帕金森病模型。采用阿扑吗啡诱导的旋转实验、转棒实验评估小鼠造模后第21日的神经功能损伤情况;末次行为学实验后,取小鼠脑组织,通过蛋白质印迹法检测脑组织纹状体及黑质区域酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)蛋白含量;免疫荧光染色观察纹状体及黑质区域衰老标志物p16Ink4a、p21的表达变化以及胶质细胞、衰老标志物双阳性的细胞数量变化;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测纹状体及黑质区域的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16Ink4a、p15Ink4b、p19Ink4d、p21和p27Kip1,以及衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)包括Cxcl10、Ccl2、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,Tnf-α)、白介素1α(interleukin-1α,Il-1α)、Il-1β、Il-6、基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,Mmp3)的表达及变化。结果·转棒实验结果显示,与Sham组相比,6-OHDA组小鼠在转棒上的停留时间较短(P=0.000);阿朴吗啡诱导的旋转实验结果显示,与Sham组相比,6-OHDA组小鼠总旋转次数较多(P=0.000);蛋白质印迹法检测结果显示,6-OHDA组纹状体及黑质区域TH蛋白表达量均显著低于Sham组(均P=0.000)。以上结果证实6-OHDA单侧纹状体小鼠帕金森病模型成功建立。免疫荧光染色结果显示:6-OHDA组纹状体和黑质区域p16Ink4a阳性细胞数量增多;p21在2组均无明显表达;6-OHDA组同时伴有衰老的星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞产生,且星形胶质细胞数量大于少突胶质细胞和小胶质细胞(均P0.05);p27Kip1轻微上调,但仅在黑质区域的差异有统计学意义(P=0.016)。与Sham组相比,6-OHDA组造模侧纹状体区域的Cxcl10、Ccl2、Tnf-α、Il-1α和Il-6显著上调,Il-1β显著下调(均P<0.05),黑质区域的Ccl2、Tnf-α、Il-1α和Il-6显著上调(均P<0.05),Mmp3和Il-1β均显著下调(均P<0.05)。结论·6-OHDA诱导的帕金森病小鼠模型表现出以p16上调和星形胶质细胞衰老为特征的衰老表型。