GPR30激活后下调P53-PUMA信号抑制全脑缺血诱导的海马神经元线粒体凋亡途径

摘要

目的采用GPR30特异激动剂、拮抗剂作为工具药,已证实GPR30激活具有抗神经炎症和抗凋亡作用。但具体机制尚不清楚。文章旨在研究揭示G蛋白耦联雌激素受体30(GPR30)激活对脑缺血后海马CA1区神经元凋亡的作用并进一步阐明其对P53-PUMA信号的影响。方法采用大鼠四动脉结扎全脑缺血模型,选择性诱导海马CA1区神经元延迟性死亡。雌性SD大鼠随机分为:假手术(Sham)组,缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)1d、3d、7d组,GPR30特异激动剂G1处理组(I/R 1d+G1,I/R 3d+G1),P53特异抑制剂Pifithrin-α(Pifi-α)处理组(Pifi-α,I/R 3d+Pifi-α,I/R 7d+Pifi-α),GPR30特异拮抗剂G36处理组(I/R 7d+Pifi-α+G36)。于大鼠切除双侧卵巢同时皮下埋置G1或G36微量释放泵,至实验结束;缺血前侧脑室注射P53抑制剂Pifi-α。Western Blot、免疫组化检测蛋白水平;TUNEL法检测海马CA1区神经元凋亡、NeuN染色观察神经元生存情况。结果激光扫描共聚焦显微镜下观察结果显示,I/R 7d组海马CA1区NeuN阳性染色细胞数量(7.500±2.320)较假手术组(61.000±2.671)减少(P<0.01),但TUNEL阳性细胞数量(73.667±5.296)增多较假手术组(3.667±1.174),差异有统计学意义(P<0.01)。与I/R 7d组相比,Pifi-α处理组海马CA1区NeuN阳性细胞数(58.143±4.783)增加(P<0.01),而TUNEL阳性细胞数(23.571±3.545)减少(P<0.01)。与I/R 7d+Pifi-α组相比,I/R 7d+Pifi-α+G36组NeuN阳性细胞数量(46.143±4.426)减少(P<0.01),而TUNEL阳性细胞数(46.143±3.985)增加(P<0.01)。Western blot结果显示,与假手术组相比,GCI后1d、3d海马CA1区P53磷酸化水平均升高(P<0.05)。与缺血/再灌注相应时间点相比,用G1激活GPR30受体降低了缺血/再灌注诱导的P53磷酸化水平(P<0.01)。免疫组化结果显示,与假手术组相比,缺血再灌注3d组海马CA1区p-P53免疫荧光强度增强,且与DAPI荧光共定位;而G1处理组类似于假手术组,显示海马CA1区p-P53免疫荧光强度较I/R 3d组降低。Western blot分析结果显示,与假手术组相比较,I/R 3d组海马CA1区PUMA水平明显升高,Bcl2水平降低(P<0.01);与I/R 3d组比较,I/R 3d+Pifi-α组PUMA蛋白降低(P<0.01),而Bcl2水平升高(P<0.01)。结论激活GPR30具有显著的神经保护作用,其作用机制与下调P53-PUMA信号通路、抑制线粒体凋亡密切相关。