绿荧光蛋白的荧光强度在D-氨基酸氧化酶活性检测中的应用

摘要

目的:探讨在转基因细胞KDfGc和KDfGd,以内部核糖体进入位点(IRES)序列连接的绿荧光蛋白(GFP)的荧光强度为单位,衡量D-氨基酸氧化酶(DAAO)活性的准确性. 方法:白血病细胞系K562e经转染含IRES序列连接的GFP和DAAO基因的逆转录病毒载体pLDfG,获得稳定表达GFP和DAAO基因的单克隆细胞KDfGc和KDfGd,以流式细胞仪和Lowry测定其荧光阳性率以及平均荧光强度、蛋白量,用D-丙氨酸(D-Ala)作用DAAO+细胞,并用酚红氧化法测定培养上清H2O2. 结果:KDfGc和KDfGd细胞的荧光阳性率分别为94.64%和96.31%.2×104细胞的平均荧光强度分别为202 U和174 U.2×104细胞的蛋白量分别为13.17 μg和7.12 μg,KDfGc、KDfGd细胞每微克蛋白量每小时产生的H2O2峰值无差异,而以单位荧光来衡量,两细胞具有明显差别. 结论:在含IRES序列的转基因细胞,以GFP的平均荧光强度为度量单位,比以细胞蛋白量能更准确地反映DAAO的活性.