猪白血病抑制因子多克隆抗体的制备及其免疫定位

摘要

目的:构建猪LIF原核表达载体,表达并纯化重组猪LIF蛋白,制备兔抗猪LIF多克隆抗体并进行免疫定位.方法:根据GenBank中猪LIF cDNA基因序列扩增出目的基因片段,将扩增的片段克隆进PET-31b表达载体的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,经转化使其在大肠杆菌BL21中表达,产生重组猪LIF蛋白,纯化后作为抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;经ELISA和Western blotting分析鉴定抗体的效价和特异性;最后利用所制备的抗体进行LIF蛋白在猪体内的免疫定位.结果:酶切和DNA测序显示,所构建的原核表达质粒PET-31b-mpLIF含有编码成熟型猪LIF蛋白的cDNA序列;表达结果显示,诱导样品在相对分子质量约20 000的位置上有明显的增强表达条带;纯化结果显示,重组蛋白在相对分子质量约20 000的位置上有一条清晰、单一的条带;通过免疫新西兰大白兔,获得了特异性较高、效价达1:10 000的多克隆抗体;应用该抗体进行的免疫定位显示,LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达.结论:重组猪LIF蛋白在大肠杆菌中进行了高效、正确表达;得到了效价较高、特异性较强的多克隆抗体;LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达.