人白细胞介素12两个亚基基因p35、p40拼接的新方法

摘要

目的:探讨人白细胞介素12(IL-12)两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接的新方法.为进一步研究IL-12基因的生物学功能以及应用提供实验基础.方法:采用两个牛弹性蛋白基序(10个氨基酸)的基因序列为两个亚基基因拼接的连接肽基因.根据人IL-12 p35、p40两个亚基基因片段以及连接肽基因核苷酸序列设计引物,其中p40基因下游引物包括部分连接肽基因序列以及Kpn Ⅰ酶切位点,p35基因上游引物包括部分连接肽基因序列以及Kpn Ⅰ酶切位点.通过聚合酶链反应(PCR)方法分别获得人IL-12 p35与p40基因片段.利用Kpn Ⅰ内切酶对p35与p40基因的PCR产物进行酶切,酶切产物回收后利用T4 DNA连接酶进行连接,应用p40基因上游引物与p35基因下游引物对连接产物进行PCR扩增.利用Kpn Ⅰ内切酶对连接产物进行酶切鉴定.将扩增的连接产物克隆入T载体,挑选阳性克隆并进行酶切鉴定,酶切鉴定正确的克隆进行拼接产物的核苷酸序列测序.结果:通过PCR分别获得约1 000 bp大小的p40基因片段与600 bp大小的p35基因片段,两个基因酶切片段连接后PCR扩增获得1 600 bp左右的拼接产物,采用Kpn Ⅰ内切酶对拼接产物进行酶切后获得约1 000和600 bp大小的基因片段,分别与p40和p35基因片段大小一致.拼接产物的T载体经酶切鉴定可见1 600 bp大小的酶切产物,拼接产物测序结果与GenBank核酸数据库上的p40基因、p35基因以及连接肽基因核苷酸序列完全一致.结论:利用该基因分子拼接技术成功地将人白介素12两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接.建立了一种简单、方便、有效进行人白细胞介素12两个亚基基因拼接的新方法,为进一步研究IL-12的C生物学功能以及基因治疗提供实验基础.