基于温控载体表达胆固醇氧化酶

摘要

胆固醇氧化酶在医药检测、食品加工、农业生产等方面都有重要的应用价值.以来源于Rhodococcus sp.的胆固醇氧化酶基因为研究对象,构建于温控表达载体pHsh上,免去了诱导剂的使用,采用温度调控使胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中成功表达.在摇瓶水平对酶的表达量进行优化,最终的酶量为855 U/L.使用镍柱将酶纯化,得到单一条带,相对分子质量约为55 kDa.分析其酶学性质,最适pH 7.0,在pH 5.0～7.0稳定;最适反应温度40℃,在50℃保温,其半衰期为6.9 min.以胆固醇为底物,在pH 7.5、37℃条件下测酶活,计算得动力学参数Km为3.38 mmol/L,kcat/Km为6.09 s-1· (mmol/L).