黄颡鱼GnRHR基因的克隆和表达及CRISPR/Cas9构建GnRHR基因敲除突变体

摘要

为研究促性腺激素释放激素受体 ( gonadotropin releasing hormone receptor, GnRHR) 对黄颡鱼Pel-teobagrus fulvidraco性别分化和性腺发育的调控作用, 采用逆转录PCR、氨基酸序列多重比对、系统进化树分析及实时定量PCR方法, 对黄颡鱼GnRHR基因的序列、表达和进化进行了研究.结果表明: 扩增到的黄颡鱼GnRHR cDNA序列长2 894 bp, 包含239 bp的5′非翻译区, 1 155 bp的开放阅读框和1 500 bp的3′非翻译区, 预测编码384个氨基酸、 7次跨膜结构域蛋白; 氨基酸序列多重比对显示, 黄颡鱼GnRHR与硬骨鱼类GnRHR的同源性较高, 其与斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus、斑马鱼Danio rerio、鲤Cyprinus carpio、银鲫Carassius auratus GnRHR氨基酸序列的一致性分别为96%、 87%、 83%和82%, 与哺乳动物的一致性较低, 为42%～44%; 系统进化分析显示, 黄颡鱼GnRHR与鲤、虹鳟等硬骨鱼类的GnRHR聚为GnRHRⅡB分支; 实时定量PCR显示, 黄颡鱼GnRHR mRNA主要在端脑、中脑、下丘脑、垂体和精巢中高表达,但在卵巢和其他组织中几乎不表达; 通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建和筛选出了黄颡鱼GnRHR突变体, 成功获得了各种不同的黄颡鱼GnRHR F0代突变体.研究表明, GnRHR可能参与调控黄颡鱼雄性发育, 黄颡鱼GnRHR F0代突变体的获取为探索GnRHR的功能和机制提供了基础资料.