利用实时荧光定量PCR法测算红螯螯虾实体组织的细胞数量

摘要

螯虾是重要的水产养殖动物,也是研究甲壳动物疾病与免疫的一个良好模型。在研究不同组织的功能及受病原感染的影响时,需要了解组织内的细胞数量。但是,目前常用的细胞计数方法仅适用于单细胞悬液,无法用于实体组织。本研究以红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)为对象,建立了基于基因拷贝数定量分析的实体组织细胞数量测算方法。首先克隆了beta-actin基因和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因(GAPDH)的部分DNA序列。在其内含子和外显子区域分别设计引物,使之只能以基因组DNA为模板进行扩增。其次,通过对实时荧光定量PCR(qPCR)熔解曲线的评估,确定以beta-actin作为目标基因。以血细胞基因组DNA为标准模板,进行beta-actin基因的qPCR分析。结果表明,在1×10~1×10^(5)个细胞的范围内,Ct值与细胞数量的对数之间呈良好的线性关系。线性回归得到回归曲线和回归方程Ct=38.30-3.37lg(N),N为细胞数量。最后,取红螯螯虾的鳃和肝胰腺组织为待测样,进行beta-actin基因qPCR分析,得到Ct值;根据上述方程计算得鳃组织细胞含量为1.8×10^(5)~2.2×10^(5)个细胞/mg组织,而肝胰腺组织细胞含量为5.5×10^(5)~6.0×10^(5)个细胞/mg组织。这一基于基因拷贝数和qPCR的细胞定量方法,具有简单便捷和高通量的优点,可用于测算螯虾实体组织的细胞数量。