拟南芥5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)的定点突变及抗草甘膦转基因拟南芥获得

摘要

目前商业化种植的抗草甘膦转基因作物中使用的基因主要是来自土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CP4和大肠杆菌(Escherichia coli)的5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyshikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)基因,抗性基因资源过于狭窄,有必要拓宽可用基因种类.本研究通过PCR方法克隆了拟南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS基因,对其进行定点突变,并将野生型基因(AtEPSPS)和突变基因(AtTIPS)分别转化EPSPS基因缺陷型大肠杆菌菌株ER2799.草甘膦抗性鉴定结果表明,含AtTIPS基因的重组菌株在20 mmol/L草甘膦胁迫条件下长势良好(P＜0.01),而含AtEPSPS基因的重组菌株在5 mmol/L的草甘膦胁迫条件下即受明显抑制(P＜0.01).同时将两个基因分别构建到植物表达载体中,并转化野生型拟南芥.对T1代转基因植株进行PCR验证和转录水平分析,证明外源基因已整合到拟南芥基因组中并正常表达.对转基因拟南芥进行草甘膦抗性分析结果表明,在0.5 mmol/L草甘膦处理下,转AtTIPS基因拟南芥相比转AtEPSPS拟南芥有更高的植株鲜重和存活率(P＜0.05),表明转AtTIPS基因拟南芥有更高的草甘膦抗性.以上结果表明AtTIPS具有较高的草甘膦抗性能力,可以用于抗草甘膦转基因作物的培育.