黄蜀葵花总黄酮通过激活AMPK/mTOR通路调控自噬改善克罗恩病肠道纤维化

摘要

目的:观察黄蜀葵花总黄酮(total flavone of Abelmoschus manihot,TFA)对肠道成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)的影响,探讨TFA治疗克罗恩病肠道纤维化的机制。方法:从SD大鼠中分离原代肠道成纤维细胞(intestinal fibroblasts,IFs),使用免疫荧光法鉴定细胞特征。利用胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)构建IFs细胞模型,随机分为对照组、模型组和TFA低、中、高剂量(5、10、50μg/mL)组。CCK-8法检测TFA及雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对IFs细胞最佳干预条件。通过免疫荧光法检测LC3Ⅱ、Beclin-1、ATG16L1及p62等自噬有关蛋白表达,使用mRFP-GFP-LC3实验检测自噬流水平。采用Western blot和qRT-PCR法测定Collagen Ⅰ水平。用AMPK抑制剂化合物C(Compound C,CC)、mTOR抑制剂RAPA联合TFA处理IGF-1刺激的IFs细胞,将细胞随机分为对照组、模型组、TFA(10μg/mL)组、TFA+CC组、TFA+RAPA组。采用免疫荧光及mRFP-GFP-LC3实验检测自噬水平。运用Western blot和qRT-PCR法评估Collagen Ⅰ水平。采用Western blot法检测p-AMPK、p-MTOR、p-p70S6K和p-4EBP1蛋白表达。结果:免疫荧光结果显示,原代细胞具有Vimentin(+),α-SMA(-)的特征,证明其为肠道成纤维细胞。CCK-8结果提示,TFA最佳干预浓度为5、10、50μg/mL,时间为48 h;RAPA最佳干预浓度为5 nmol/mL,时间为48 h。与对照组相比,模型组的Collagen Ⅰ蛋白及mRNA水平上升(P <0.01),自噬有关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1、ATG16L1等表达减弱,p62表达上升,自噬流减少,p-AMPK/AMPK比值降低,p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K和p-4EBP1/4EBP1比值升高(P <0.01)。与模型组相比,TFA各剂量组Collagen Ⅰ水平降低(P <0.01),自噬水平上升,其中高剂量组最明显;TFA(10μg/mL)组p-AMPK/AMPK比值上调,p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K和p-4EBP1/4EBP1比值下调(P <0.01)。与TFA组相比,TFA+CC组中CollagenⅠ水平升高(P <0.01),自噬水平下降,p-AMPK/AMPK比值下降,p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K和p-4EBP1/4EBP1比值上升(P <0.01);TFA+RAPA组中CollagenⅠ水平降低(P <0.01),自噬水平上升,p-AMPK/AMPK比值增加,p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K和p-4EBP1/4EBP1比值降低(P <0.01)。结论:TFA可以通过激活AMPK/mTOR通路调节细胞自噬以抑制Ⅰ型胶原蛋白生成,改善肠道纤维化。