D-氨基酸氧化酶在毕赤酵母中的表达及快速纯化

摘要

目的 建立简便、快速纯化D-氨基酸氧化酶(DAAO)的新方法,以利用高纯度的DAAO转化头孢菌素C制备戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸(GL-7ACA).方法 通过基因工程手段,构建N端和C端各镶嵌6个组氨酸的DAAO重组质粒,电转化Pichia pastoris GS115电感受态细胞,利用PCR方法筛选阳性转化子,再经甲醇诱导筛选出高表达菌.结果 高表达重组菌(PHD12)摇瓶发酵单位达到2 000 IU/L,发酵罐内达到22 500 IU/L.并利用Ni螯合型树脂对表达的DAAO经一步分离纯化,以60%的总收率获得纯化产物.纯化产物保持良好的转化CPC-Na活性.结论 利用基因工程表达组氨酸标记蛋白,可简化基因工程的下游工序.