稳定沉默TRB3细胞模型及TRB3启动子报告基因的建立

摘要

构建人TRB3基因的shRNA真核表达载体和稳定沉默TRB3的人结肠癌细胞系HCT-8,构建TRB3启动子区的荧光素酶报告基因,为以TRB3为靶点的药物研究提供有效的筛选平台。针对TRB3的mRNA设计寡核苷酸序列,构建TRB3-shRNA表达载体和control-shRNA阴性对照载体,宿主菌扩增,并测序鉴定。测序正确的重组质粒转染HCT-8细胞,以潮霉素筛选,分别建立稳定表达TRB3-shRNA和control-shRNA的HCT-8细胞系。通过细胞划痕-修复实验检测细胞的迁移能力。同时,通过克隆、酶切、连接、转化和扩增,构建TRB3启动子区的荧光素酶报告基因pTRB3-Luc,转染HEK293ET细胞并给予衣霉素刺激,检测荧光素酶报告基因的活性。经测序证实,TRB3-shRNA真核表达载体构建成功,插入的DNA片段与设计序列完全一致。在建立的稳定表达TRB3-shRNA的HCT-8细胞中,TRB3的mRNA和蛋白表达水平都显著下降,细胞的迁移能力显著降低。同时,TRB3启动子区荧光素酶报告基因pTRB3-Luc构建成功,并在衣霉素诱导下呈现剂量依赖性的活性增强。TRB3-shRNA重组质粒、稳定沉默TRB3的HCT-8细胞系和TRB3启动子报告基因的建立为进一步研究TRB3在肿瘤发生发展过程中的作用以及TRB3抑制剂的筛选提供了有力的工具。