高亲和力抗Met人源基因工程抗体scFv的筛选与特性分析

摘要

目的应用噬菌体展示技术制备抗HGF受体Met特异性、高亲和力的全人抗体scFv片段。方法以从天然抗体库中筛选出的Fab基因可变区VH和VL为模板,分别在CDR区引入有限突变和随机突变,扩增出scFv基因库,克隆于pComb3XSS中,构建scFv次级突变抗体库,筛选高亲和力克隆。结果经5轮细胞筛选和2轮抗原固相筛选,选取60个克隆进行ELISA检测,选择较高亲和力的噬菌体抗体,克隆于原核表达载体pBAD-gIII/A中,经诱导表达、SDS-PAGE和Westernblotting分析,在相对分子质量30000处出现预期大小的蛋白条带。单链抗体经表达、变性与复性和IMAC亲和纯化后,用于流式细胞术、免疫沉淀分析,结果表明,scFv能够与S114细胞表达Met的胞外区特异性结合,其亲和常数Kd值为4.76×10-8mol/L,与突变前抗体的亲和力(Kd值为5.24×10-6mol/L)相比,抗体的亲和力提高约100倍。竞争ELISA结果显示,亲和力成熟后抗体的抗原结合表位未变。结论经过CDR突变和抗体库筛选,有效提高了抗体的亲和力,该抗体有望成为临床肿瘤诊断或治疗的候选分子。