“胰岛代理细胞”的构建:在HepG2细胞中获得胰岛素分泌

摘要

目的:利用转基因技术将HepG2细胞改建为具有生理性胰岛素分泌能力的“胰岛代理细胞”. 方法:以携葡萄糖激酶(glucokinase,gk)基因的逆转录病毒及携入胰岛素原基因突变体(mutant proinsulin gene, mpin)的逆转录病毒共同感染肝母细胞瘤细胞系HepG2, G418选择培养基挑选抗性细胞集落,放免法、SDS- PAGE、Western-blot及反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR) 鉴定HepG2细胞中两个目的基因的转录及表达;选取联合表达葡萄糖激酶及成熟胰岛素的HepG2细胞进行葡萄糖反应性胰岛素分泌的检测,以单独表达成熟胰岛素的HepG2 细胞作对照. 结果:在G418选择培养基中3wk获阳性细胞克隆,采用放免法、SDS-PAGE、Western-blot从20个细胞克隆中挑选出联合表达葡萄糖激酶及成熟胰岛素的HepG2细胞4 株,其中1株2个目的基因表达均较强,命名为细胞克隆“β”;经RT-PCR检测证实细胞“β”中已有两个目的基因的转录.在细胞“β”中,葡萄糖浓度为0.5 mmol/L和0.75 mmol/L时,胰岛素的分泌无显著性差异(P>0.05); 葡萄糖浓度为2.0 mmol/L,3.0 mmol/L,4.0 mmol/L, 5.0 mmol/L及6.0 mmol/L时,胰岛素的分泌无显著性差异(P>0.05);其余葡萄糖浓度条件下,胰岛素的分泌差异均有显著性意义(P0.05).说明在细胞“β”中获得了葡萄糖反应性胰岛素分泌,葡萄糖浓度约1.75-2 mmol/L时出现胰岛素分泌高峰. 结论:成功构建了具有生理性胰岛素分泌能力的“胰岛代理细胞”系.