siRNA沉默DNMT1对人乳腺癌细胞MCF-7生长的影响

摘要

目的靶向人DNMT1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)构建RNA干扰载体,研究其对乳腺癌细胞周期、增殖及凋亡的影响。方法靶向DNMT1基因设计三条短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)的寡核苷酸片段,构建重组体pGCsi-DNMT1,转染至乳腺癌细胞株MCF-7,定量PCR法检测DNMT1mRNA表达水平;流式细胞技术分析细胞周期的变化;MTT法检测细胞生长情况;Annexin V/PI双染法观察细胞凋亡情况;定量PCR法分析沉默DNMT1基因后对RASSF1A、p16、p21、p27及ERβ基因表达的影响。结果在构建的靶向DNMT1的shRNA重组质粒pGCsi-DNMT1中,成功筛选到pGCsi-T3能显著下调DNMT1的表达。实时定量PCR检测结果证实重组质粒pGCsi-DNMT1对乳腺癌MCF-7细胞中DNMT1基因的转录有明显的抑制作用。MCF-7细胞转染后,pGCsi-DNMT1可明显抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖;大量细胞发生凋亡;细胞周期分析可见S期明显减少,而G1/G0期细胞显著增加;定量PCR检测到乳腺癌细胞中RASSF1A、p16、p21及ERβ基因mRNA表达水平明显升高,而p27基因表达水平未见明显变化。结论重组质粒pGCsi-DNMT1能特异有效地抑制MCF-7细胞内DNMT1的表达、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,并可通过抑制DNMT1的活性来解除相关基因启动子区的高度甲基化状态,从而促进肿瘤相关基因的表达,提示DNMT1可作为乳腺癌基因治疗的新靶标。